एक आनुवंशिक दृष्टिकोण के रूप में अध्ययन करने के लिए सहायक टी कोशिकाओं की रेट्रोवायरल पारगमन तंत्र उनके भेदभाव और फंक्शन को नियंत्रित करना
Summary
कई प्रायोगिक प्रणाली तंत्र एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में टी सेल के विकास और समारोह के विनियमन को समझने के लिए उपयोग किया गया है। यहाँ एक आनुवंशिक रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग कर दृष्टिकोण वर्णन किया गया है, जो आर्थिक, समय, कुशल, और नियामक रास्ते की पहचान करने में सबसे महत्वपूर्ण बात, अत्यधिक जानकारीपूर्ण है।
Abstract
Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.
Introduction
The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative.
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function.
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses.
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.
Protocol
Representative Results
Discussion
के रूप में उनके विकास और समारोह अक्सर प्रमुख नियामकों की अभिव्यक्ति के स्तर से निर्धारित होता है जीन की रेट्रोवायरल मध्यस्थता overexpression, सहायक टी कोशिकाओं में समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। लेकिन, परिणाम की व्याख्या सतर्क क्योंकि काफी अंतर्जात जीन के उन लोगों के ऊपर अभिव्यक्ति के स्तर में कई कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं की आवश्यकता है। इसलिए, इस तकनीक समारोह की प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए अन्य लोगों के साथ जोड़ा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, overexpression siRNAs या जीन नॉकआउट का उपयोग कर यदि उपलब्ध कम अभिव्यक्ति से पूरित किया जाना चाहिए। MiRNAs के साथ, हम वायरस है कि कृत्रिम miRNA को लक्षित साइटों है कि एक miRNA 15 के लिए के रूप में प्रतिस्पर्धी अवरोधकों काम किया overexpressed का उपयोग करके अवरुद्ध करने में उन लोगों के साथ overexpression प्रयोगों पूरित। रेट्रोवायरल transduced कोशिकाओं को भी जैव रासायनिक शाही सेना और प्रोटीन विश्लेषण शामिल assays में उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, इन प्रयोगों की एक प्रमुख सीमा पारगमन संसाधन और अन्य विभागों की दक्षता हैट्रांसड्यूस और untransduced कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में ulting। इसलिए, इन assays सबसे अधिक संभावना + GFP आबादी की छंटाई की आवश्यकता होगी। अंत में, इन विट्रो भेदभाव assays में विवो प्रयोगों के साथ जोड़ा जाना चाहिए, और एक तरह से यह प्राप्त किया जा सकता adoptively चूहों में transduced टी कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए और उनके भेदभाव और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर उनके प्रभाव पालन कर रहा है।
इस प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक आरएनए जीनोम कि रेट्रोवायरल capsid में पैक किया जा सकता है के आकार है। हमारे अनुभव में, यह अच्छा वायरस उत्पादन देता मिग रेट्रोवायरल प्रणाली के लिए अधिकतम डालने आकार 3-3.5 KB है। इसलिए, बड़ा जीन, इस प्रणाली के साथ विश्लेषण नहीं किया जा सकता क्योंकि वे गरीब वायरस titers दे। हालांकि, ज्यादातर जीनों इस आकार की तुलना में छोटे होते हैं इसलिए इस प्रणाली के जीन के अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए उपयोगी है।
रेट्रोवायरल पारगमन, इन protoco के भीतर कई विकल्पों के साथरास इस्तेमाल किया गया है। कई शोधकर्ताओं पैकेजिंग सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक रेट्रोवायरल जीन (उदाहरण के लिए संदर्भित 16) को व्यक्त कि उपयोग किया है। हालांकि, हम पीसीएल-पारिस्थितिकी सहायक वायरस वेक्टर के सह अभिकर्मक के साथ मानक HEK 293T कोशिकाओं का उपयोग उच्चतम titers प्राप्त किया है। भोले सहायक टी कोशिकाओं के अलगाव भी सेल चुंबकीय मनका और सेल जुदाई स्तंभ प्रोटोकॉल के बजाय छँटाई के माध्यम से हासिल किया जा सकता है, लेकिन यह एक सेल सॉर्टर के लिए उपयोग की आवश्यकता है, और तरह समय के लिए लागत आम तौर पर मनका अभिकर्मकों की तुलना में अधिक है। अंत में, वहाँ विभिन्न सबसेट में सहायक टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल सक्रियण की स्थिति पर बदलाव कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, बहुत देर के लिए कोशिकाओं की TCR उत्तेजना Treg उत्प्रेरण की स्थिति के लिए जोखिम से पहले उनके प्रेरण 16 को बाधित कर सकते हैं। यह एक समस्या हो सकती है क्योंकि रेट्रोवायरल अभिव्यक्ति कोशिका विभाजन कोशिकाओं की उत्तेजना से प्रेरित आवश्यकता है। फिर भी, हम हे / एन activ के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग कुशल Treg प्रेरण पाया हैव्यावहारिक रेट्रोवायरल पारगमन से पहले।
इन प्रोटोकॉल के भीतर, सफल आवेदन कई कारकों की आवश्यकता है। उच्च अनुमापांक रेट्रोवायरस तैयारियों HEK 293T कोशिकाओं तो उच्च गुणवत्ता डीएनए और ठीक तैयार 2x HBS के कुशल अभिकर्मक की जरूरत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, HEK 293T कोशिकाओं के घनत्व सेल अभिकर्मक के बिंदु पर लगभग 50% होने की जरूरत है क्योंकि ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए की अच्छी अभिव्यक्ति की आवश्यकता है कि कोशिकाओं को सक्रिय रूप से बढ़ रहे हैं, और इस हिचकते होगा यदि कोशिकाओं को भी विरल या घने हैं। अभिकर्मक के दौरान इष्टतम घनत्व में कोशिकाओं को वायरस संग्रह चरणों के दौरान कुछ बिंदु पर संगम तक पहुंच जाना चाहिए, लेकिन वे पिछले संग्रह करने के लिए सभी तरह के माध्यम से उच्च अनुमापांक वायरस शेयरों का निर्माण जारी रहेगा। सहायक टी कोशिकाओं के कुशल भेदभाव अच्छा सेल गुणवत्ता इतनी है कि यह सुनिश्चित अलग कक्षों पवित्रता चित्रा 1 में सचित्र कर रहे हैं की आवश्यकता है। इसी तरह, कोशिकाओं की गुणवत्ता चूहों fr पर निर्भर हैओम जो वे अलग थे। इन अध्ययनों के लिए, हम 6-8 सप्ताह पुरानी C57BL / 6 चूहों का इस्तेमाल किया है। बड़े चूहों कम भोले कोशिकाओं हो सकता है, और अन्य नस्लों उनके भेदभाव में अलग हो सकता है। उदाहरण के लिए, BALB / ग चूहों अधिक C57BL / 6 चूहों 17 से Th2 प्रतिक्रियाओं होने का खतरा जैसा कि ऊपर कहा गया है C57BL 6 / टी कोशिकाओं एक Th2 प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, भेदभाव शर्तों के किसी भी प्रयोगशाला में प्रयोगशाला से थोड़ा भिन्न हो सकते हैं, और जीन overexpression का प्रभाव केवल उप इष्टतम परिस्थितियों में स्पष्ट हो सकता है तो विभिन्न ध्रुवीकरण की स्थिति में साइटोकाइन सांद्रता titrated होना पड़ सकता है। अंत में, सेल प्रसार पर overexpressed जीन का प्रभाव या ध्रुवीकरण की स्थिति पारगमन दक्षता इसलिए ब्याज की जीन के प्रभाव को मापने के समय और ध्रुवीकरण अभिकर्मकों की एकाग्रता के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती प्रभावित कर सकते हैं। इन सभी कारकों का अनुकूलन इस प्रणाली के साथ जानकारीपूर्ण परिणाम के लिए नेतृत्व करना चाहिए।
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Sigma | P4333 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| DPBS | Sigma | D8537 | |
| MIG vector | Addgene | Plasmid 9094 | |
| pCL-Eco vector | Addgene | Plasmid 12371 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Magnetic beads mouse CD4 cell kit | Invitrogen (Dynabeads) | 11415D | |
| Streptavidin Beads | Miltenyi Biotech | 130-048-102 | |
| MS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| LS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| CD25 Biotenylated MAb | BD Biosciences | 85059 | clone 7D4 |
| CD62L Biotenylated MAb | BD Biosciences | 553149 | clone MEL-14 |
| Polybrene (Hexadimethrine Bromide) | Sigma | 107689 | |
| Anti-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | clone 145-2C11 |
| Anti-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | clone 37.51 |
| Anti-IL-4 | BD Biosciences | 559062 | clone 11B11 |
| Anti-IFN-gamma | BD Biosciences | 559065 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554425 | cloneJES6-5H4 |
| Recombinant IL-12 p70 | eBiosciences | 14-8121 | |
| Recombinant IL-4 | BD Biosciences | 550067 | |
| Recombinant TGF-beta | eBiosciences | 14-8342-62 | |
| Recombinant IL-6 | eBiosciences | 14-8061 | |
| Recombinant IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Brefeldin A | eBiosciences | 00-4506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling |
| Foxp3 staining buffer set | eBiosciences | 00-5523 | |
| Anti-CD4 FITC | eBiosciences | 11-0041 | clone GK1.5 |
| Anti-CD8a perCP-cy5.5 | eBiosciences | 45-0081-80 | clone 53-6.7 |
| Anti-MHCII PE | eBiosciences | 12-0920 | clone HIS19 |
| Anti-CD25 PE | eBiosciences | 12-0251-82 | clone PC61.5 |
| Anti-CD62L PE | eBiosciences | 12-0621-82 | clone MEL-14 |
| Anti-CD44 APC | eBiosciences | 17-0441 | clone IM7 |
| Anti-IFN-gamma FITC | eBiosciences | 11-7311-81 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-4 PE | BD Biosciences | 554435 | clone 11B11 |
| Anti-IL-9 PE or APC | eBiosciences/Biolegend | 50-8091-82/514104 | clone RM9A4 |
| Anti-IL-17a PE | BD Biosciences | 559502 | clone TC11-18H10 |
| Anti-Foxp3 APC or PE | eBiosciences | 17-5773-82/12-5773-80 | clone FJK-16s |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | 71643 | |
| Dextrose/Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES, free acid | Sigma | H3375 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Disodium EDTA | Sigma | D2900000 | |
| KHCO3 | Sigma | 237205 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 |
Riferimenti
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