Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Wei Shen; Wenqing Li; Julie A. Hixon; Caroline Andrews; Scott K. Durum

doi:10.3791/54710

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

8.7K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54710

⸱

25 gennaio 2017

Wei Shen¹ , Wenqing Li¹ , Julie A. Hixon¹ , Caroline Andrews¹ , Scott K. Durum¹

¹Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un modello di topo reporter transgenico per visualizzare le cellule produttrici di IL-22 all'interno di diversi tessuti di topo. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la posizione di altre citochine o proteine secretarie nel topo.

Abstract

topi reporter sono stati ampiamente utilizzati per osservare la localizzazione di espressione dei geni target. Questo protocollo si concentra su una strategia per stabilire un nuovo modello di topo transgenico giornalista. Abbiamo scelto di visualizzare interleuchina (IL) 22 genica perché questa citochina ha importanti attività nell'intestino, dove contribuisce a riparare tessuti danneggiati da infiammazione. Sistemi Reporter offrono notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dei prodotti in vivo. Nel caso di IL-22, altri studi avevano prima isolato cellule dai tessuti e poi ri-stimolate le cellule in vitro. IL-22, che è normalmente secreta, è stato intrappolato all'interno delle cellule usando un farmaco e la colorazione intracellulare è stato usato per visualizzarla. Questo metodo identifica le cellule capaci di produrre IL-22, ma non ne determina che facevano così in vivo. Il design giornalista comprende l'inserimento di un gene per una proteina fluorescente (tdTomato) nel IL-22 gene in tale way che la proteina fluorescente non può essere secreto e quindi rimane intrappolata all'interno delle cellule che producono in vivo. Produttori fluorescenti possono quindi essere visualizzati in sezioni di tessuto o ex vivo analisi tramite citometria a flusso. Il processo di costruzione vera e propria per il giornalista incluso recombineering un cromosoma artificiale batterico che conteneva il gene IL-22. Questo cromosoma multistrato è stato poi introdotto nel genoma del mouse. Omeostatico IL-22 espressione reporter è stato osservato in diversi tessuti di topo, tra cui la milza, timo, linfonodi, le placche di Peyer, e intestino, mediante citometria a flusso di analisi. La colite è stata indotta da cellule T (CD4 ⁺ CD45RBhigh) di trasferimento, ed espressione reporter è stato visualizzato. Le cellule T positive erano prima presenti nei linfonodi mesenterici, e quindi hanno accumulato all'interno della lamina propria delle piccole tessuti dell'intestino e del colon distale. La strategia con BAC ha dato espressione giornalista buona fedeltà rispetto a IL-22 Expressione, ed è più semplice di procedure knock-in.

Introduzione

Cellule specifiche del tipo di espressione di geni reporter è utile per identificare le cellule che esprimono attivamente il target in tessuti sotto stati omeostatiche e perturbate. Permette anche per la purificazione di queste cellule, che rimangono vitali, per studiare le altre proprietà. topi reporter sono stati utilizzati nel chiarire il meccanismo di azione di specifiche citochine, fattori di trascrizione, e elementi regolatori. Strategie Precedente ^{^1,} ^{^2,} ³ sono in gran parte affidamento sul battendo il giornalista nel locus bersaglio nel topo cromosoma, una procedura c....