La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
reportero ratones han sido ampliamente utilizados para observar la localización de la expresión de determinados genes. Este protocolo se centra en una estrategia para establecer un nuevo modelo de ratón transgénico reportero. Elegimos para visualizar la expresión de genes de interleucina (IL) 22, porque esta citocina tiene actividades importantes en el intestino, donde contribuye a reparar los tejidos dañados por la inflamación. Los sistemas indicadores ofrecen considerables ventajas sobre otros métodos de identificación de productos en vivo. En el caso de IL-22, otros estudios habían aislado primero las células de los tejidos y luego se volvieron a estimular las células in vitro. IL-22, que normalmente se secreta, estaba atrapado dentro de las células usando un fármaco, y la tinción intracelular se utiliza para visualizar la misma. Este método identifica células capaces de producir IL-22, pero no determina si lo hacían en vivo. El diseño reportero incluye la inserción de un gen de una proteína fluorescente (tdTomato) en el gen IL-22 en un wa talesy que la proteína fluorescente no puede ser secretada y por lo tanto permanece atrapado dentro de las células productoras en vivo. Productores fluorescentes pueden ser visualizados en secciones de tejido o por análisis ex vivo a través de citometría de flujo. El proceso de construcción real para el reportero incluido recombinería un cromosoma artificial bacteriano que contenía el gen de IL-22. Se introdujo entonces este cromosoma por ingeniería genética en el genoma del ratón. IL-22 expresión reportero homeostático se observó en diferentes tejidos de ratón, incluyendo el bazo, timo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, y el intestino, por citometría de flujo análisis. La colitis se indujo mediante la transferencia de células T (CD4 + CD45RBhigh), y la expresión del indicador se visualizó. células T positivos fueron primero presente en los ganglios linfáticos mesentéricos, y luego se acumulan dentro de la lámina propia de los pequeños tejidos delgado y el colon distal. La estrategia de usar BAC dio expresión del indicador buena fidelidad en comparación con IL-22 expresSion, y es más simple que los procedimientos de knock-in.
Introduction
Celular de expresión de tipo específico de genes informadores es útil para identificar células que expresan activamente el objetivo en los tejidos debajo de estados homeostáticos y perturbados. También permite la purificación de estas células, que se mantienen viables, para estudiar sus otras propiedades. reportero ratones se han utilizado para elucidar el mecanismo de acción de citoquinas específicas, factores de transcripción, y elementos reguladores. Estrategias anteriores 1, 2, 3 se han basado en gran medida en golpear el reportero en el locus diana en el cromosoma de ratón, un procedimiento que consume tiempo y costoso. Por lo tanto, un método más simple para la generación de ratones reportero es deseable.
Las citoquinas son una amplia clase de pequeñas, proteínas secretadas / péptidos que regulan la respuesta inmune a través de la señalización intercelular. La interleucina 22 (IL-22) es una citoquina con muchas actividades reportados, incluyendo fu barreranción, reparación de tejidos, la inflamación y 4. Aunque la IL-22 se descubrió inicialmente como un producto de las células T 5, los informes posteriores demostraron su expresión en las células asesinas naturales (NK) en los seres humanos y los ratones 6 7 y en otras clases de linfocitos innatas 8. A pesar de una extensa observación de las células productoras-22 IL, visualización de la IL-22 se requería previamente la estimulación ex vivo y permeabilización a las manchas con anticuerpos. Por lo tanto, la novela de IL-22 reportero ratones serían una herramienta muy útil para investigar la función de IL-22 en los procesos homeostáticos y patógenos.
Aquí, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico reportero simplificada para observar las células IL-22-que producen in vivo e in vitro. El uso de un método de BAC recombinería 9, insertamos la secuencia de ADNc tdTomato con poli A fragmentos de señal en el loc IL-22nosotros y reemplazado exón 1. Las otras regiones, los exones, y elementos reguladores sin traducir no fueron perturbados, ya que nos gustaría imitar la regulación natural de la IL-22 tanto como sea posible. El sitio de inserción reportero interrumpe la secuencia señal, lo que resulta en la acumulación de la reportera en el interior de las células que producen, a diferencia de IL-22 en sí, que es secretada rápidamente. Este nuevo método puede aplicarse también a la generación de ratones reportero de otras proteínas secretadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 juega un papel esencial en la defensa innata y tejido huésped remodelación. Células-22 productoras de IL han identificado ex vivo mediante tinción intracelular. Sin embargo, sigue siendo difícil de rastrear la expresión de IL-22 in situ, ya sea en el estado normal o en condiciones inflamatorias. Este protocolo describe un nuevo método para desarrollar un IL-22 reportero modelo de ratón, lo que nos permite localizar las células indicadoras que expresan in vivo. El gen informador …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Riferimenti
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
