에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em> 체외</em> 암 모델
Summary
여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.
Abstract
약물 내성은 혈액 학적 악성 종양 및 고형 종양 모두 암의 치료에서 주요 문제로 남아있다. 극한 후천적 내성이 증가 된 약제를 포함 제거 메커니즘들에 의해 야기 될 수 있고, 약물 흡수, 불 활성화 약물 및 약물 표적의 변경을 감소시켰다. 최근 데이터는 다른 이상이 잘 알려진 유전자 (돌연변이, 증폭) 및 후생 유전 학적 (DNA 메틸화, 히스톤 번역 후 변형) 개조로, 약제 내성 메커니즘도 스 플라이 싱 수차에 의해 조절 될 수 있음을 보여 주었다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 계획하기 위해 미래의 관심을받을 자격이 조사 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사 대상으로합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열 및 설정을 통해 체외 모델에서 여러 가지의 transcriptomic 프로필을 분석에드 QRT-PCR 기반의 방법은 후보 유전자의 유효성을 검사합니다. 특히, 우리는 DDX5와 PKM 성적 증명서의 차동 스 플라이 싱을 평가 하였다. 계산 도구 매트에 의해 검출 된 비정상적인 스 플라이 싱은 다른 DDX5 스플 라이스 변종은 부모의 대 내성 세포에서 발현되는 것을 보여주는, 백혈병 세포에서 확인되었다. 이러한 세포에서는,도 타빈 노광에 의한 약제 내성의 다른 메커니즘을 제안 부모 Panc-1 세포에 비해 Panc-1 타빈 강한 상대 검출되지 않았다 높은 PKM2 / PKM1 비를 관찰 하였다.
Introduction
암 치료, 화학 요법에 대한 종양 세포의 내성 중 진성 또는 장기간 약물 노출시 획득 상당한 발전에도 불구하고, 백혈병 및 고형 종양 1 광범위한 치료 실패의 주요 원인이다.
시험관 세포주 모델 약물 내성의 기초가되는 메커니즘을 묘사하기 위해 화학 요법 제에 내성 암세포의 선택에 의해 단계적으로 개발된다. 이 절차는 임상에서 사용 된 체제를 모방하고, 따라서 적절한 저항 메커니즘 깊이 조사를 허용한다. 치료 후에도 내성 세포를 세포 생존력 / 세포 독성 분석 (2)를 사용하여 부모 감수성 세포와 구별된다. 일차 세포의 시험 관내 약물 내성 프로파일 화학 요법에 대한 임상 적 반응 (3)에 크게 관련이있는 것으로 밝혀졌다.
높은 처리량 cytotoxicity 분석법은 시험관 내에서 약물의 감도를 결정하는 편리한 방법을 구성한다. 여기서, 세포의 생존 능력에 의해 평가되어 예를 들면, 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 – 즉 특정 기판의 대사 전환 (에 기초 MTT 분석법 4, 따라서 세포의 미토콘드리아 활성을 반영 컬러 제품에 테트라 졸륨 염). 대안 적으로, 세포의 단백질 함량은에 sulforhodamine B (SRB) 검정을 이용하여 5 정량화 할 수있다. 여기서, 생존 세포의 수의 필요없이, 분광 광도계에 적합한 파장에서 측정 된 광학 밀도 (OD)에 비례 광범위하고 시간이 걸리는 셀 카운팅 절차. 소정의 화학 요법 약물에 의해 유도되는 성장 억제는 세포가 시험 제제로 처리하고, 처리되지 않은 대조군 세포의 OD와 비교하고있는 웰의 OD에 기초하여 계산 될 수있다. 용량 – 반응 곡선이다 obta세포를 제어 할 상대 생존 세포의 비율에 비해 약물 농도를 플로팅 리트에 의해. 마지막으로, 약물 감수성은 미처리 세포 (IC 50)에 비하여 세포 성장의 50 % 저해를 초래 농도로서보고 될 수있다.
약제 내성의 기초가되는 메카니즘은 약물 활성 및 세포 대사의 결정 인자의 유전자 발현에 영향을 미치는 변경 등 여러 가지 이상을 포함한다. 돌연변이, 수차 전사에서와 전사 후 수준뿐만 아니라 방해 후생 유전 학적 조절을 포함하여이 분자 병변은 종종 약물 대사 또는 세포 사멸 6 중 관련된 유전자에 영향을 미칩니다.
대체 사전 mRNA의 접합과 복잡한 규제는 최근 암 세포 (7)의 약물 내성을 지시 할 수있는 새로운 개체로 주목을 받았다. 인간 유전자의 95 %까지 이러한 대안의 수단에 의해 정상 세포에 접합되고동일한 유전자에서 다양한 단백질 이소 형을 생성 단단히 조절 방법. 대체 접합은 종종 암에 규제가 완화되고, 여러 종양은 약물 대사 (즉, 데 옥시 시티 딘 키나제, folylpolyglutamate 합성, 또는 다제 내성 단백질) 6,8에 관여하는 유전자의 증가의 변형 접합을 특징으로한다. 그러나, 약제 내성 세포의 접합 프로파일의 포괄적 인 분석을 고통스럽게 부족하다. 따라서, 대안적인 스 플라이 싱 분석을위한 높은 처리량의 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될.
지난 10 년간 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 급속한 발전은 유전자 발현의 조절 및 다양한 생물학적 과정 (9)에서 자신의 역할을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력과 생물 의학 연구를 강화하고있다. RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 강력한 서브 프로그램이고transcriptomics의 분야에서 NGS의. 그것은의 miRNA, siRNA를, 및 기타 소형 RNA를 (정량적)을 동시에 수천 개의 유전자의 발현 패턴의 게놈 전체의 프로파일 링을 허용하고도 새로운 코딩의 mRNA의 특성에 적합 아니라 긴 비 코딩 RNA이다 클래스 (예를 들어, snRNA와 피르) 10, 11.
RNA-SEQ 사체는 특성 (예를 들면, 생거 시퀀싱 및 발현 마이크로 어레이)에 대한 이전의 기술에 비해 많은 장점을 갖는다. 그것은 기존의 게놈 주석에 기초하지 않고, 그 해상도의 단일 뉴클레오티드 레벨을 가지며 그 발현 량 추정을위한 넓은 동적 범위를 갖는다. 간단히, RNA-SEQ 실험의 기본 실험 워크 플로우의 cDNA 라이브러리 건설 그리고 마지막으로, 대규모 병렬 깊은 시퀀싱 (12, 13)로 변환 한 다음 폴리아 데 닐화 성적 증명서 (mRNA를) 선택과 분열로 구성되어 있습니다. 때문에 sequencin의 급격한 하락지난 몇 년 동안, RNA-SEQ 위에 g 비용이 점차 다른 기술을 대체하고, 상당한 노력은 라이브러리 제조 프로토콜을 향상시키기 위해 이루어지고있다. 예를 들어, 옥시 우리 딘 트리 포스페이트 (dUTP를)하고, 이전의 PCR로 증폭, 우라실-DNA-glycosilase (UDG)로 표시 가닥을 소화와 두 번째 가닥 cDNA를 표시하여 mRNA의 성적 증명서의 가닥 정보를 유지하는 것이 가능하다. 이 프로세스는 발현 14,15 유전자 주석 및 추정의 정확도를 향상시킨다.
분석 및 RNA-서열 데이터의 해석은 생물 정보학 파이프 라인 16, 17 내에서 복잡하고 강력한 계산 소프트웨어 패키지 및 처리가 필요합니다. 우선, 원료는 엄격한 품질 기준에 도달하지 않는 서열을 기술 및 생물 인공물을 제거하고 폐기 (트리밍)에서 품질 관리를 거쳐 판독한다. 이어서,이 기준 게놈 맵핑 및 각 인덱싱 된 샘플 읽기유전자 수준, 엑손 수준, 또는 성적 증명서 수준에 순서대로 각 카테고리의 풍요 로움을 확인합니다. 애플리케이션에 따라, 정제 된 데이터는 대립 유전자 – 특이 적 발현, 대체 접합 유전자 융합체 및 단일 염기 다형성 (SNP가) (12)의 식별을위한 통계 모델을 통해 계산된다. 마지막으로, 선택된 레벨 (즉, 유전자 발현 또는 대체 스 플라이 싱) 차등 분석은 다양한 조건 하에서 얻어진 샘플과 비교하기 위해 사용될 수있다.
차동 접합 분석은 두 샘플 사이의 스플 라이스 사이트 사용의 차이를 설명합니다. 이 목적에 전념 소프트웨어 패키지의 증가는 다른 통계 모델, 성능 및 사용자 인터페이스 (18)에 따라 사용할 수 있습니다. 이 중, 매트 (성적 증명서 접합의 다변량 분석) 베이지안 통계 프레임 워크를 기반으로 자유롭게 사용할 수 있으며 정확한 계산 도구로 나온다과 diffe를 감지하도록 설계단일 또는 쌍으로 최종 RNA-서열 데이터 중 하나에서 rential 접합 이벤트. 정렬 (.bam) 파일에서 시작, 매트 대체 접합 이벤트의 모든 주요 유형을 검색 할 수 있습니다 (엑손 스키핑, 대안 3 '스플 라이스 사이트, 다른 5'스플 라이스 사이트, 상호 배타적 인 엑손과 인트론 보존 – 또한 그림 1 참조).
첫째, 소프트웨어 식별 인스턴스 엑손 스킵, 특정 스플 라이스 이벤트를 지원하는 판독하고, 두 종류로 분류한다. 조사 된 엑손 내에서지도 및 특정 엑손 두 업스트림 및 다운 스트림 측면 엑손 사이의 접합에 걸쳐 (정식 스플 라이스 이벤트) "에 포함될 읽습니다". 두 측면 엑손 간의 접합부에 걸쳐 (대체 접합 이벤트) "스킵 읽기". 그 후, 매트는 모두 정규 및 대체 이벤트에 대한 정규화 된 포함 수준을 반환하고 샘플 또는 조건 사이의 값을 비교합니다. 궁극적으로는 P-값 a를 계산ND 잘못된 탐색 비율 (FDR)은 두 상태 사이의 유전자 변형 비의 차이는 각각의 스 플라이 싱 19,34 이벤트에 대해 주어진 사용자 정의 임계 값을 초과한다고 가정.
RNA-SEQ와 함께 차동 플라이 싱 분석에 따라, 광범위한 실험적인 검증이 참 양성 유전자 후보 (18)를 식별하기 위해 보장된다. 정량적 역전사 – 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)은 RNA 서열 분석-20에서 얻은 후보 확인에 가장 일반적으로 사용되는 최적의 방법이다. 본 연구의 목적은 고형 종양과 혈액 악성 종양의 약물 내성 관련 접합 프로파일을 조사 할 수있는 강력한 방법을 제공하는 것이다. 우리의 방법은 약제 내성에 관여 후보 유전자의 확인을 위해 설립 QRT-PCR 방법과 조합하여 약제 내성 암 선택된 세포주 모델 RNA-SEQ 기반 사체 프로파일을 이용한다.
<p class = "jove_content">이 연구에 사용 된 인간 백혈병 세포주 모델 소아 T- 세포 급성 림프 모구 백혈병을 포함 (T-ALL) 세포주 CCRF-CEM (CEM-WT), 두개의 글루코 코르티코이드 (GC) 모성 서브 클론 CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) 및 CEM-C7R5 (CEM-R5) (21, 22)와 메토트렉세이트 (MTX) 모성 서브 라인 CEM / R30dm 23. GC를하고 MTX에 기초하여 현재 요법의 경우 약 90 %가 임상적인 이점을 수립했지만, GC 저항의 출현은 아직 불분명 분자 메커니즘 미해결 문제를 나타낸다. GC 강한 서브 클론을 분리, CEM-WT 세포는 2 ~ 3 주 동안 1 μM의 덱사메타손 (덱스)에서 배양 하였다. MTX 내성 서브 라인 CEM / R30dm 반복 단기 (24 시간) 임상 프로토콜의 모방으로 30 μM MTX에 CEM-WT 세포의 노출을 통해 개발되었다. 흥미롭게도,이 세포주는 또한기구가 완전히 이해되지 않은 덱스에 교차 내성 (미공개 결과)을 표시.고체 다치또는 본 연구에서 조사 모델은 화학 요법과의 특별한 불응 악명 췌장 도관 선암이다. 이를 위해 Panc-1 세포주 및 약물 (24)의 1 μM 연속 배양에 의해 얻어진 그 타빈 내성 서브 클론 Panc-1R를 선택했다. 여기에서는 세 개의 프로토콜을 결합하여 체외 약물 내성 근본적인 새로운 메커니즘을 발견하는 방법을 설명합니다 비색 독성 분석법에 관련된 신규 스플 라이스 변이체를 식별 백혈병 세포 및 고형 종양, RNA-SEQ 기반 파이프 라인에서 암 세포에 약물 감수성을 평가 약물 감도 / 저항과 RT-PCR 및 QRT-PCR 분석은 잠재적 인 후보의 유효성을 검사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 약물 내성과 관련하여 차동 접합 이벤트를 식별하는 분석을 잘 확립 된 세포 독성 스크리닝 기술과 강력한 NGS 기반 transcriptomic을 결합하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 분광 분석은 시험 관내 암 모델에서 약물 민감도를 평가하기 편리하고 강력한 높은 처리량 방법이며, 세포 독성 검사를 수행하는 많은 실험실에 대한 첫 번째 선택을 나타냅니다. 이 방법에 대한 문제 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
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