En utilisant l'ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d'épissage associés à la résistance aux médicaments dans<em> In vitro</em> Modèles de cancer

Summary

Nous décrivons ici un protocole visant à étudier l'impact de l'épissage aberrant sur la résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Pour cet objectif, nous avons analysé les profils transcriptomiques des modèles parentaux et résistants in vitro par l' ARN-seq et établi une méthode basée qRT-PCR pour valider les gènes candidats.

Abstract

La résistance aux médicaments reste un problème majeur dans le traitement du cancer chez les hémopathies malignes et des tumeurs solides. La résistance intrinsèque ou acquise peut être causée par une série de mécanismes, y compris augmentation de l'élimination de la drogue, une diminution de l'absorption de drogue, inactivation et altérations des cibles médicamenteuses. Des données récentes ont montré que d'autres que par génétique (mutation, amplification) et des modifications épigénétiques bien connu (ADN hypermethylation, modification post-traductionnelle des histones), les mécanismes de résistance aux médicaments peut également être régulée par des aberrations d'épissage. Ceci est un domaine en croissance rapide de l'enquête qui mérite une attention future afin de planifier des approches thérapeutiques plus efficaces. Le protocole décrit dans le présent document vise à étudier l'impact de l'épissage aberrant sur la résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Pour cet objectif, nous avons analysé les profils transcriptomiques de plusieurs modèles in vitro par l' ARN-seq et d' établired un qRT-PCR méthode basée pour valider les gènes candidats. En particulier, nous avons évalué l'épissage différentiel de DDX5 et PKM transcriptions. L'épissage aberrant détecté par l'outil de calcul MATS a été validée dans des cellules leucémiques, montrant différentes variantes d'épissage DDX5 sont exprimés dans les cellules résistantes au contre parental. Dans ces cellules, nous avons également observé un PKM2 supérieur rapport signal / bruit PKM1 qui n'a pas été détecté dans le Panc-1 homologue gemcitabine résistant par rapport aux cellules parentales Panc-1, ce qui suggère un mécanisme différent de résistance à un médicament induit par l'exposition de la gemcitabine.

Introduction

En dépit des progrès considérables dans le traitement du cancer, de la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie, soit intrinsèque ou acquise lors de l' exposition prolongée du médicament, est la principale raison de l' échec du traitement dans un large éventail de leucémies et des tumeurs solides ^1.

Afin de délimiter les mécanismes sous – tendant la résistance aux médicaments, dans les modèles de lignées cellulaires in vitro sont développés par sélection progressive de cellules cancéreuses résistantes aux agents chimiothérapeutiques. Cette procédure imite les régimes utilisés dans les paramètres cliniques et permet donc une enquête approfondie des mécanismes de résistance pertinents. Cellules résistantes qui survivent au traitement sont ensuite distingués des cellules sensibles parentales en utilisant des essais viabilité des cellules / cytotoxicité ^2. Ont été présentés dans les profils de résistance aux médicaments in vitro de cellules primaires significativement lié à la réponse clinique à la chimiothérapie ^3.

Haut-débit cytotodes essais de xicité constituent un procédé commode pour déterminer la sensibilité aux médicaments in vitro. Ici, la viabilité des cellules est évaluée par , par exemple , l'acide 3- [4,5-diméthylthiazol-2-yl] -2,5-diphényl tétrazolium – test MTT ^4, qui est basée sur la conversion métabolique de certains substrats ( à savoir, les sels de tétrazolium) en produits colorés, reflétant ainsi l'activité mitochondriale des cellules. En variante, la teneur en protéine cellulaire peut être quantifiée en utilisant la sulforhodamine B (SRB) Essai ^5. Ici, le nombre de cellules viables est proportionnelle à la densité optique (DO) mesurée à une longueur d'onde appropriée dans un spectrophotomètre, sans avoir besoin de extensif et chronophage les méthodes de comptage des cellules. L'inhibition de la croissance induite par un certain médicament chimiothérapeutique peut être calculé en fonction de la DO des puits dans lesquels les cellules ont été traitées avec un agent de test et comparé avec la DO des cellules témoins non traitées. Une courbe dose-réponse est bénéficier du droitiné en traçant les concentrations de médicament par rapport aux pourcentages de cellules viables par rapport aux cellules témoins. Enfin, la sensibilité aux médicaments peut être rapportée comme étant la concentration qui entraîne 50% d'inhibition de la croissance cellulaire par rapport aux cellules non traitées (CI _50).

Les mécanismes sous-tendant la résistance aux médicaments comprennent de nombreuses anomalies différentes, telles que des modifications qui affectent l'expression des gènes des déterminants de l'activité du médicament et du métabolisme cellulaire. Ces lésions moléculaires, y compris des mutations, des aberrations à une transcription et niveau post-transcriptionnel, ainsi que la régulation épigénétique perturbé affectent souvent les gènes impliqués soit dans le métabolisme des médicaments ou de l' apoptose ^6.

Épissage alternatif pré-ARNm et sa régulation complexe ont récemment reçu une attention considérable en tant qu'entité nouvelle qui peut dicter la résistance aux médicaments des cellules cancéreuses ^7. Jusqu'à 95% des gènes humains sont alternativement épissé dans les cellules normales au moyen de ceprocessus strictement réglementé qui produit beaucoup de différentes isoformes de protéines du même gène. L' épissage alternatif est souvent dérégulée dans le cancer et plusieurs tumeurs sont caractérisées par un épissage modifié d'un nombre croissant de gènes impliqués dans le métabolisme des médicaments (c. -à- désoxycytidine kinase, synthétase folylpolyglutamate, ou des protéines de multirésistance) ^6,8. Cependant, une analyse complète des profils d'épissage de cellules résistantes aux médicaments est cruellement défaut. Par conséquent, il est impératif de développer des méthodes à haut débit pour l'analyse de l'épissage alternatif. Cela pourrait aider à développer des approches thérapeutiques plus efficaces.

Au cours de la dernière décennie, le développement rapide de séquençage de prochaine génération (NGS) technologies a enrichi la recherche biomédicale avec de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires qui régissent la régulation de l' expression du génome et leur rôle dans divers processus biologiques ^9. ARN-séquençage (ARN-seq) est une sous-application puissantede NGS dans le domaine de la transcriptomique. Il permet un profilage du génome entier (qualitativement et quantitativement) des profils d'expression de milliers de gènes simultanément et est bien adapté pour la caractérisation de nouveaux ARNm codant ainsi que de longue ARN non codant, miRNA, siRNA, et d'autres petits ARN classes (par exemple, snARN et Pirna) ^10,11.

ARN-Seq présente de nombreux avantages par rapport aux technologies précédentes pour la caractérisation du transcriptome (par exemple, le séquençage Sanger et microarrays d'expression). Il ne repose pas sur l'annotation du génome existant, il a un niveau de résolution de nucléotide unique et dispose d'une plage dynamique plus large pour l'estimation du niveau d'expression. En bref, le flux de travail expérimental de base des expériences d'ARN-seq se compose de transcription polyadénylé (ARNm) la sélection et la fragmentation, suivie par la conversion en ADNc, la construction de la bibliothèque et le séquençage profond enfin, massivement parallèle ^12,13. En raison de la chute rapide de sequencinles coûts de g au cours des dernières quelques années, l'ARN-seq remplace progressivement d'autres technologies et des efforts importants sont faits pour améliorer les protocoles de préparation de la bibliothèque. Par exemple, il est maintenant possible de conserver les informations de brin de transcrits d'ARNm en marquant le deuxième brin d'ADNc avec désoxyuridine triphosphate (dUTP) et, avant l'amplification par PCR, digérer le brin marqué avec l'uracile-ADN-glycosilase (UDG). Ce processus améliore la précision de l' annotation des gènes et de l' estimation des niveaux d'expression ^14,15.

L'analyse et l' interprétation des données d'ARN-seq nécessitent des paquets et le traitement logiciel de calcul complexes et puissants dans les pipelines bioinformatiques ^16,17. D'abord, la première lit subissent un contrôle de qualité en supprimant les artefacts techniques et biologiques et le rejet (rognage) les séquences qui ne parviennent pas à des exigences de qualité strictes. Par la suite les lectures pour chaque échantillon sont mappés à un génome de référence et indexéesdans le niveau des gènes, niveau exon, ou niveau de transcription, afin de déterminer l'abondance de chaque catégorie. Selon l'application, les données raffinées sont ensuite calculées au moyen de modèles statistiques pour l'identification de l' expression spécifique d'allèle, l' épissage alternatif, des fusions de gènes et des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ^12. Enfin, l' analyse différentielle au niveau choisi ( par exemple, l' expression du gène ou de l' épissage alternatif) peut être utilisé pour comparer les échantillons obtenus dans différentes conditions.

analyse de l'épissage différentiel décrit les différences dans l'utilisation du site d'épissage entre deux échantillons. Un nombre croissant de logiciels consacrés à cette fin sont disponibles en fonction des différents modèles statistiques, les performances et l' interface utilisateur ^18. Parmi ceux-ci, MATS (multivariée Analyse de la transcription Splicing) apparaît comme un outil de calcul disponible gratuitement et précise basée sur un cadre statistique bayésienne et conçus pour détecter les difféévénements d'épissage rentielles provenant soit des données d'ARN-seq uniques ou jumelés finaux. A partir des (.bam) fichiers alignés, MATS peut détecter tous les principaux types d'événements alternatifs d'épissage (exon de saut, variante 3 'site d'épissage alternatives 5' site d'épissage, exons mutuellement exclusifs et la rétention d'intron – voir aussi la figure 1).

Tout d'abord, le logiciel identifie lit qui supporte un certain événement d'épissage, par exemple le saut d'exon, et les classe en deux types. «L'inclusion lit" (pour l'événement d'épissage canonique) carte dans le exon étudié et couvrent les jonctions entre cette exon spécifique et les deux exons flanquant en amont et en aval. "Skipping lit" (pour l'événement d'épissage alternatif) couvrent la jonction entre les deux exons adjacents. Par la suite, MATS retourne le niveau d'inclusion normalisée pour les deux événements canoniques et alternatives et compare les valeurs entre les échantillons ou les conditions. En fin de compte, il calcule la valeur P ae taux de fausses découvertes (FDR) , en supposant que la différence dans le rapport de la variante d'un gène entre deux conditions dépasse un seuil défini par l' utilisateur donné pour chaque événement d'épissage ^19,34.

Suite à l' analyse de l' épissage différentiel en liaison avec l' ARN-seq, une validation expérimentale approfondie est justifiée afin d'identifier les gènes candidats vrais positifs ^18. Inverse quantitative réaction en chaîne transcrite-polymérase (qRT-PCR) est la méthode la plus couramment utilisée et optimale dans la validation des candidats obtenus à partir de l' ARN-Seq analyse ^20. Le but de ce document est de fournir une méthodologie solide pour étudier les profils d'épissage liés résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Notre approche utilise à base d'ARN-seq-transcriptome profilage des modèles de lignées cellulaires sélectionnées de cancers résistants aux médicaments en combinaison avec une méthode qRT-PCR établie pour la validation de gènes candidats impliqués dans la résistance aux médicaments.

<p class = "jove_content"> Les modèles de lignées cellulaires de la leucémie humaine utilisés dans cette étude comprenaient des cellules T pédiatrique leucémie aiguë lymphoblastique (T-ALL) lignée cellulaire CCRF-CEM (CEM-WT), ses deux glucocorticoïdes (GC) -Résistant subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) et CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 et le méthotrexate (MTX) -Résistant CEM – lignée / R30dm ^23. Bien que les traitements actuels à base de glucocorticoïdes et MTX établissent un bénéfice clinique dans environ 90% des cas, l'émergence de GC-résistance représente encore un problème non résolu avec un mécanisme moléculaire claire. Pour isoler les sous-clones résistants GC, les cellules CEM-WT ont été cultivées dans 1 uM de dexaméthasone (Dex) pendant 2 à 3 semaines. MTX-lignée résistante CEM / R30dm a été développé grâce à court terme répétées (24 h) de l'exposition des cellules CEM-WT à 30 uM MTX comme un synoptique des protocoles cliniques. Fait intéressant, cette lignée cellulaire a également affiché une résistance croisée à Dex (résultats non publiés) pour laquelle le mécanisme ne soit pas complètement compris.

Le tum solideou le modèle étudié dans la présente étude est l'adénocarcinome canalaire pancréatique, notoire pour son réfractarité extraordinaire à la chimiothérapie. À cette fin, nous avons choisi la ligne Panc-1 cellule et son sous-clone de gemcitabine résistant Panc-1R obtenu par incubation continue avec 1 uM du médicament ^24. Ici , nous décrivons une méthode pour découvrir de nouveaux mécanismes sous – jacents in vitro la résistance aux médicaments en combinant trois protocoles suivants: essais de cytotoxicité colorimétrique pour évaluer la sensibilité aux médicaments dans des cellules leucémiques et des cellules cancéreuses provenant de tumeurs solides, d'un pipeline d'ARN-seq basée pour identifier de nouveaux variants d'épissage liés à drogue sensibilité / résistance et RT-PCR et l'analyse qRT-PCR pour valider les candidats potentiels.

Protocol

1. Caractérisation des drogues Profils de résistance par cytotoxicité Leucémique Culture cellulaire Ligne Maintenir le T-cellule parentale ALL lignée cellulaire CCRF-CEM (CEM-WT), ainsi que ses lignées résistantes aux médicaments, y compris CEM / R30dm, CEM-R5 et CEM-C3, dans 25 cm 2 dans un milieu de 10 ml de RPMI-1640 contenant 2,3 pM d'acide folique supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 100 unités / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de strept…

Representative Results

Les essais de cytotoxicité décrites dans le protocole fournissent un procédé fiable et robuste pour évaluer la résistance des cellules cancéreuses à des agents chimiothérapeutiques in vitro. Au moyen du test MTT, la sensibilité à la Dex a été déterminée en quatre lignes LAL-T cellulaires, y compris les cellules parentales Dex sensibles CEM-WT, et trois sous-lignées Dex-résistants: CEM / R30dm, CEM-R5 et CEM-C3. Deux gammes de concentrations différentes ont dû …

Discussion

Nous décrivons ici une nouvelle approche qui combine les techniques de dépistage cytotoxicité bien établis et puissants transcriptomique à base NGS analyses pour identifier les événements d'épissage différentiels par rapport à la résistance aux médicaments. Dosages spectrophotométriques sont des méthodes à haut débit commodes et robustes pour évaluer la sensibilité aux médicaments dans des modèles in vitro du cancer et représentent le premier choix pour de nombreux laboratoires qui effe…

Materials

Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140