Brug RNA-sekventering til Detect Novel Splice Varianter Relateret til Drug Resistance i<em> In vitro</em> Kræft Modeller

Summary

Her beskriver vi en protokol til formål at undersøge effekten af ​​afvigende splejsning på resistens i solide tumorer og blodkræftsygdomme. Til dette mål, vi analyserede transkriptom profiler af forældrenes og resistente in vitro modeller gennem RNA-seq og etablerede et QRT-PCR-metode til at validere kandidatgener.

Abstract

Lægemiddelresistens fortsat et stort problem i behandlingen af ​​kræft for såvel blodkræftsygdomme som solide kræftsvulster. Iboende eller erhvervet resistens kan være forårsaget af en række mekanismer, herunder øget lægemiddelelimination, nedsat optagelse af lægemiddel, medikament inaktivering og ændringer af lægemiddelkandidater. Nylige data viste, at anden måde end ved kendte genetiske (mutation, amplifikation) og epigenetiske (DNA hypermethylering, histon post-translationel modifikation) modifikationer, drug resistensmekanismer kan også reguleres ved splejsning aberrationer. Dette er en hastigt voksende felt af undersøgelse, der fortjener fremtidig opmærksomhed for at planlægge mere effektive behandlingsmetoder. Den i dette dokument Protokollen skal undersøge virkningen af ​​uregelmæssig splejsning på lægemiddelresistens i solide tumorer og hæmatologiske maligniteter. Til dette mål, vi analyserede transkriptom profiler af flere in vitro modeller gennem RNA-seq og etablereed en QRT-PCR-metode til at validere kandidatgener. Især vi vurderet den differentielle splejsning af DDX5 og PKM udskrifter. Den uregelmæssig splejsning detekteres af beregningsmæssige værktøj MATS blev valideret i leukæmiceller, der viser, at forskellige DDX5 splejsningsvarianter er udtrykt i de parentale vs. resistente celler. I disse celler har vi også observeret en højere PKM2 / PKM1-forhold, som ikke blev detekteret i Panc-1 gemcitabin-resistent modstykke i forhold til parentale Panc-1-celler, hvilket antyder en anden mekanisme af lægemiddel-resistens fremkaldt af gemcitabin eksponering.

Introduction

Trods betydelige fremskridt i kræftbehandlingen, modstand af maligne celler til kemoterapi, enten iboende eller erhvervet ved længere tids påvirkning af narkotika, er den vigtigste årsag til behandlingssvigt i en bred vifte af leukæmi og solide tumorer ^1.

For at afgrænse mekanismerne bag resistens, in vitro cellelinie modeller er udviklet ved trinvis udvælgelse af kræftceller resistente over for kemoterapeutiske midler. Denne procedure efterligner regimer anvendt i de kliniske omgivelser og tillader derfor indgående efterforskning af relevante resistensmekanismer. Resistente celler, som overlever behandling derefter skelnes fra parentale følsomme celler ved hjælp cellelevedygtighed / cytotoksicitetsassays ^2. In vitro medikamentresistens profiler af primære celler har vist sig at være signifikant relateret til klinisk respons på kemoterapi ^3.

High-throughput cytotoxicity assays udgør en bekvem metode til at bestemme lægemiddelfølsomhed in vitro. Heri er levedygtigheden af celler vurderet ved for eksempel 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid – MTT assay ^4, som er baseret på metabolisk omdannelse af visse substrater (dvs. tetrazoliumsalte) i farvede produkter, og dermed afspejler den mitokondrielle aktivitet af celler. Alternativt kan det cellulære proteinindhold kvantificeres ved anvendelse af sulforhodamin B (SRB) assay ^5. Her er antallet af levedygtige celler er proportional med den optiske densitet (OD) målt ved en passende bølgelængde i et spektrofotometer, uden behov for omfattende og tidskrævende celletælling procedurer. Vækstinhiberingen induceret af en bestemt kemoterapeutisk lægemiddel kan beregnes på basis af OD af brøndene, hvor celler blev behandlet med et testmiddel og sammenlignes med OD af ubehandlede kontrolceller. En dosis-respons-kurve er SKAFFESined ved afbildning lægemiddelkoncentrationer versus procentdele af levedygtige celler i forhold til kontrolceller. Endelig kan lægemiddelfølsomhed rapporteres som den koncentration, som resulterer i 50% af cellevækstinhiberingen sammenlignet med ubehandlede celler _(IC50).

Mekanismerne bag lægemiddelresistens omfatter mange forskellige abnormiteter, såsom ændringer påvirker genekspression af determinanter for lægemiddelaktivitet og cellulær metabolisme. Disse molekylære læsioner, herunder mutationer, afvigelser på en transkriptionel og post-transkriptionel niveau samt forstyrret epigenetisk regulering påvirker ofte gener involveret enten i stofskiftet stof eller apoptose ^6.

Alternativ præ-mRNA splejsning og dens indviklede regulering har for nylig fået stor opmærksomhed som en ny enhed, der kan diktere resistens af kræftceller ^7. Op til 95% af humane gener er alternativt splejset i normale celler ved hjælp af dennestramt reguleret proces, som frembringer mange forskellige protein-isoformer fra det samme gen. Alternativ splejsning er ofte dereguleret i cancer og flere tumorer er karakteriseret ved ændret splejsning af et stigende antal gener involveret i lægemiddelmetabolisme (dvs. deoxycytidinkinase, folylpolyglutamate syntetase, eller multiresistens proteiner) ^6,8. Imidlertid er omfattende analyse af splejsning profiler af lægemiddelresistente celler smerteligt mangler. Derfor er det bydende nødvendigt at udvikle høje throughput metoder til alternativ splejsning analyse. Dette kunne være med til at udvikle mere effektive behandlingsmetoder.

I det seneste årti, har den hurtige udvikling af næste generations sekventering (NGS) teknologier beriget biomedicinsk forskning med nye indsigter i de molekylære mekanismer, der styrer reguleringen af genom udtryk og deres rolle i forskellige biologiske processer ^9. RNA-sekventering (RNA-seq) er en kraftfuld sub-ansøgningaf NGS inden for transcriptomics. Det tillader en genom-dækkende profilering (både kvalitativt og kvantitativt) af ekspressionsmønstre for tusinder af gener samtidigt og er velegnet til karakterisering af hidtil ukendte kodende mRNA'er såvel som lang ikke-kodende RNA, miRNA, siRNA, og andre små RNA klasser (f.eks snRNA og Pirna) ^10,11.

RNA-Seq har mange fordele i forhold til tidligere teknologier til transkriptom karakterisering (f.eks Sanger sekventering og ekspression microarrays). Den er ikke baseret på eksisterende genom annotation, det har en enkelt-nukleotid niveau af opløsning og det har en bredere dynamisk område til ekspression estimering. Kort beskrevet er den grundlæggende eksperimentelle arbejdsgang af RNA-seq eksperimenter består af polyadenyleret transkript (mRNA) udvælgelse og fragmentering, efterfulgt af omdannelse til cDNA, bibliotekskonstruktion og endelig massivt parallelle dyb sekventering ^12,13. På grund af hurtig dråbe sequencing omkostninger over sidste par år, RNA-seq gradvist at erstatte andre teknologier og der gøres en stor indsats for at forbedre biblioteket forberedelse protokoller. For eksempel er det nu muligt at tilbageholde strengen informationer om mRNA-transkripter ved at markere den anden streng cDNA med deoxyuridintriphosphat (dUTP) og, før PCR-amplifikation, fordøjelse af mærket strengen med uracil-DNA-glycosilase (UDG). Denne proces øger nøjagtigheden af gen annotation og estimering af ekspressionsniveauerne ^14,15.

Analysen og fortolkningen af RNA-seq data kræver komplekse og kraftige beregningsmæssige softwarepakker og forarbejdning i bioinformatiske rørledninger ^16,17. For det første rå læser gennemgår kvalitetskontrol ved at fjerne tekniske og biologiske genstande og kassere (trimning) de sekvenser, som ikke når strenge kvalitetskrav. Efterfølgende læser for hver prøve mappes på en reference-genom og indeksereti gen-niveau, exon-niveau, eller transkript-plan, for at bestemme den overflod af hver kategori. Afhængig af anvendelsen, er raffinerede data beregnes derefter gennem statistiske modeller til identifikation af allel-specifikke udtryk, alternativ splejsning, genfusioner og enkeltværelser nukleotid polymorfier (SNPs) ^12. Endelig kan anvendes differentiel analyse på valgte niveau (dvs. genekspression eller alternativ splejsning) at sammenligne prøver opnået under forskellige betingelser.

Differential splejsning analyse beskriver forskellene i brugen splejsningssted mellem to prøver. Et stigende antal softwarepakker, der afsættes til dette formål findes baseret på forskellige statistiske modeller, forestillinger og brugergrænseflade ^18. Blandt disse, MATS (multivariat analyse af Transcript splejsning) fremstår som en frit tilgængelig og præcis beregningsmæssige værktøj baseret på en Bayesian statistiske rammer og designet til at detektere diffedifferentielle splejsning begivenheder fra enten enkelt eller parret ende RNA-seq data. Startende fra de justerede (.bam) filer, kan MATS detektere alle vigtige typer alternative splejsningsbegivenheder (exon skipping, alternative 3'-splejsningssted, alternative 5'-splejsningssted, som gensidigt udelukker hinanden exoner og intron retention – se også figur 1).

Først software identificerer læser som understøtter en vis splejsning begivenhed, for eksempel exon skipping, og klassificerer dem i to typer. "Inklusion læser" (for den kanoniske splejse begivenhed) kort inden den undersøgte exon og span splejsningspunkter mellem den specifikke exon og de to opstrøms og nedstrøms flankerende exons. "Skipping læser" (for den alternative splejsning begivenhed) spænde krydset mellem de to flankerende exons. Efterfølgende MATS returnerer normaliserede inklusion niveauet for både de kanoniske og alternative arrangementer og sammenligner værdierne mellem prøver eller betingelser. I sidste ende, det beregner P-værdi ennd falsk opdagelse sats (FDR) antager, at forskellen i variant forholdet af et gen mellem to betingelser overstiger en given brugerdefineret tærskel for hver splejsningsbegivenhed ^19,34.

Efter differentiel splejsning analyse i forbindelse med RNA-seq, er en omfattende eksperimentel validering berettiget for at identificere ægte positive gen kandidater ^18. Kvantitativ revers transkriberet-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) er den mest almindeligt anvendte og optimale metode i validering af ansøgere opnået fra RNA-Seq analyse ^20. Formålet med dette oplæg er at give en robust metode til at undersøge resistens-relaterede splejsning profiler i solide tumorer og blodkræftsygdomme. Vores tilgang udnytter RNA-seq-baserede transkriptom profilering af udvalgte cellelinje modeller af lægemiddelresistente kræftformer i kombination med en etableret QRT-PCR-metode til validering af kandidatgener impliceret i resistens.

<p class = "jove_content"> De humane leukæmicellelinie modeller, der anvendes i denne undersøgelse omfattede pædiatriske T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) cellelinie CCRF-CEM (CEM-WT), dens to glucocorticoid (GC) resistent subkloner CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) og CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 og methotrexat (MTX) resistent sublinie CEM / R30dm ^23. Selvom nuværende behandlinger baseret på GC'ers og MTX etablere klinisk fordel i omkring 90% af tilfældene, fremkomsten af ​​GC-resistens udgør stadig et uløst problem med en uklar molekylære mekanisme. Til isolering GC-resistente sub-kloner, CEM-WT-celler blev dyrket i 1 uM dexamethason (Dex) i 2 til 3 uger. MTX-resistente sublinie CEM / R30dm blev udviklet gennem gentagne korte (24 timer) eksponering af CEM-WT celler til 30 uM MTX som efterligner af kliniske protokoller. Interessant denne cellelinie viste også krydsresistens over for Dex (upublicerede resultater), hvor mekanismen ikke er helt forstået.

Det faste tumeller model undersøgt i den foreliggende undersøgelse er pancreatisk duktalt adenokarcinom, berygtet for sin usædvanlige resistens over for kemoterapi. Til dette formål valgte vi Panc-1-cellelinien og dets gemcitabin-resistente sub-klon Panc-1R fremstillet ved kontinuerlig inkubering med 1 uM af medikamentet ^24. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at opdage hidtil ukendte mekanismer bag in vitro resistens ved at kombinere tre protokoller: kolorimetriske cytotoksicitetsanalyser at vurdere lægemiddelfølsomhed i leukæmiske celler og cancerceller fra solide tumorer, RNA-seq-baseret pipeline til at identificere hidtil ukendte splejsningsvarianter relateret til lægemiddelfølsomhed / modstand og RT-PCR og QRT-PCR-analyse for at validere potentielle kandidater.

Protocol

1. Karakterisering af Drug Resistance profiler gennem cytotoksicitetsanalyser Leukæmiske cellelinje Culture Opretholde den parentale T-celle ALL cellelinje CCRF-CEM (CEM-WT) samt dens lægemiddelresistente underlinjer, herunder CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3, i 25 cm2 i 10 ml RPMI-1640 medium indeholdende 2,3 uM folinsyre suppleret med 10% føtalt kalveserum og 100 enheder / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin. Dyrke cellerne i en fugtig atmosfære ved 37…

Representative Results

De cytotoksicitetsassays beskrevet i protokollen tilvejebringe en pålidelig og robust metode til at vurdere modstanden af cancerceller til kemoterapimidler in vitro. Ved hjælp af MTT-assayet, blev følsomhed over for Dex bestemt i fire T-ALL cellelinjer, herunder Dex-følsomme parentale CEM-WT-celler, og tre Dex-resistente underlinjer: CEM / R30dm, CEM-R5 og CEM-C3. To forskellige koncentrationsintervaller skulle anvendes på grund af den store forskel i følsomhed mellem CEM-…

Discussion

Her beskriver vi en ny tilgang, der kombinerer veletablerede cytotoksicitet screeningsteknikker og kraftfuld NGS-baserede transkriptom analyser for at identificere differentiel splejsning hændelser i forhold til medikamentresistens. Spektrofotometriske analyser er praktisk og robust high-throughput metoder til at vurdere narkotika følsomhed i in vitro kræftmodeller og repræsenterer det første valg for mange laboratorier, der udfører cytotoksicitet screeninger. Fejlfinding samt mulige variationer til denne…

Materials

Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140