Detección de<em> Trypanosoma brucei</em> Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Summary

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Abstract

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Introduction

El parásito protozoario Trypanosoma brucei, es un agente causal de las enfermedades que afectan a los seres humanos (a través de brucei gambiense y Trypanosoma rhodesiense Trypanosoma brucei) y animales (a través de Trypanosoma brucei brucei) en toda el África subsahariana. Se transmite al huésped de mamífero a través de la saliva de la mosca tsé-tsé vector. Tanto humanos como la tripanosomiasis africana animales causan una carga económica grave en las regiones endémicas, y pocos fármacos están disponibles o en desarrollo para tratar cualquiera de las enfermedades. La comprensión de los mecanismos de evasión inmune es crítico para el desarrollo de fármacos para la tripanosomiasis. La variación antigénica de la densa, la variante glicoproteína de superficie (VSG) la capa que cubre el parásito es uno de los principales medios por los cuales T. brucei evade la respuesta de anticuerpos de los mamíferos. Existen aproximadamente 2000 variantes del gen VSG en el genoma tripanosoma, pero sólo uno se transcribe en un momento dado de una de ~ 15 expressitios de Sión. 'Cambio' de la VSG expresada puede ocurrir ya sea mediante la copia de un gen VSG en el sitio de expresión activa, o por la activación transcripcional de un sitio de expresión previamente silenciosa (revisado en ^1).

Aunque mucho trabajo se ha dedicado a la comprensión de la variación antigénica en T. brucei, los factores que influyen en la frecuencia de conmutación son aún poco conocidos. Los estudios realizados hasta la fecha se han visto obstaculizados por el hecho de que mientras que la conmutación se produce estocásticamente in vitro, frecuencias de conmutación son muy bajos, del orden de 1 a unos 10 ⁶ células ^2. Esto hace que sea difícil de medir si un determinado factor aumenta o disminuye la frecuencia de conmutación, ya que el cambio es difícil de detectar en el primer lugar. Antes de 2009, los métodos para el aislamiento de los conmutadores en una población dada eran muy largo y laborioso. Estas células pases a través de tripanosomas ratones inmunizados contra la VSG dominante y luego, la cosecha incluidosun día más tarde ^3, o contar cientos de células por inmunofluorescencia ^4,5. Otra estrategia se basa en la selección para la resistencia a los medicamentos para aislar conmutadores ^6. Debido a que los tripanosomas africanos cultivadas in vitro se hacen típicamente de una gran población que expresa una variante importante, y una población mucho más pequeña de conmutadores que expresan variantes alternativas, nos referimos a la variante importante en todo este documento como la VSG dominante, de partida. Al hacerlo, que de ninguna manera deseamos dar a entender que esta importante variante tiene una mayor aptitud que otras variantes en la población.

Aquí se describe un método que se puede medir de manera fiable el número de tripanosomas que expresa un VSG no dominante en una población dada en 3-4 horas. Este método es particularmente útil para cuando se quiere determinar si una manipulación genética dado o tratamiento con fármacos aumenta el número de células de conmutación en una población. En lugar de liberar a la población de células que expresan el dominante, a partir VSG través de las drogas o por medios inmunológicos, estas células son eliminadas por primera recubrimiento con perlas magnéticas acopladas al anticuerpo contra la VSG dominante y luego aislarlos en una columna magnética. La población de conmutación se recoge entonces en el flujo a través y se tiñó otra vez con un anticuerpo marcado anti-VSG fluoróforo para identificar contaminantes. La cuantificación se logra mediante la adición de un número definido de contar bolas absolutas para cada muestra de manera que la relación de perlas a células se puede determinar y se usa para cuantificar el número de conmutadores en la población ^7.

Protocol

NOTA: Durante todo el procedimiento, es necesario para mantener las células en hielo. medios fríos también deben utilizarse en todas partes. La recolección de la muestra 1. Crecer Lister 427 tripanosomas cepa del torrente sanguíneo a una densidad de 0,5 – 1 millones / ml. Lo mejor es comenzar culturas con un pequeño número de parásitos. Centrifugar 50 x 10 6 células / muestra durante 10 minutos a 1.500 x g. Asegúrese de dejar 1 x 10 6 células en cu…

Representative Results

El método aquí descrito se utilizó para demostrar que las roturas de doble hebra dentro del sitio de expresión VSG aumentado el número de conmutadores en una población 8. Aquí, mostramos los resultados representativos de una población de tripanosomas que han sido inducidos de manera similar para generar una rotura de doble cadena en el lugar de expresión. Comparamos estos tripanosomas a aquellos que no han sido inducidos para generar una rotura de doble cadena. <stron…

Discussion

Con respecto a la técnica experimental, el componente más crítico del protocolo es mantener todas las muestras frío. Los tripanosomas internalizan muy rápidamente anticuerpo unido a su superficie ^9, pero este proceso es dependiente de la motilidad, y no influye en el ensayo, siempre y cuando las células se mantienen a 4 ° C. Todas las muestras deben mantenerse siempre en hielo, y pipeteo debe hacerse rápidamente para minimizar la exposición al ambiente de laboratorio C 25 °. Fría HMI-9 con suero de…

Materials

unlabeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
fluorophore labeled anti-VSG antibody	n/a	n/a	VSG antibody is made in house
HMI-9 media	n/a	n/a	HMI-9 is made in house
Propidium Iodide	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute counting beads	Thermofisher Scientific	C36950
LD columns	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS magnetic separator	Miltenyi Biotech	130-042-302
vortex adapter-60	ThermoFisher scientific	AM10014
flow cytometer	Coulter	n/a
flow cytometer analysis software	FloJo	n/a