We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.
स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों प्रतिरक्षात्मक आत्म सहिष्णुता की कमी के कारण उत्पन्न होती हैं। विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) immunologic आत्म सहिष्णुता की महत्वपूर्ण मध्यस्थों हैं। , चूहों और इंसानों में परिपक्व सीडी 4+ टी सेल उप-जनसंख्या के 10% के बारे में 1 के साथ – – Tregs के बारे में 5 प्रतिनिधित्व करते हैं उन Tregs परिधीय रक्त में घूम के 2%। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) कार्यात्मक Tregs है, जो एक संभावित स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों की सेल आधारित चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है में भेदभाव किया जा सकता है। यहाँ, हम IPSCs से प्रतिजन (एजी) विशिष्ट Tregs (यानी, IPSC-Tregs) विकसित करने के लिए एक तरीका मौजूद है। विधि IPSCs में प्रतिलेखन कारक Foxp3 और एक एजी विशेष टी सेल रिसेप्टर (TCR) को शामिल करने और फिर OP9 stromal कोशिकाओं पायदान व्यक्त पर फर्क पर आधारित है डेल्टा-तरह (डीएल) 1 और DL4 ligands। इन विट्रो भेदभाव के बाद, IPSC-Tregs सीडी 4, सीडी 8, CD3, CD25, Foxp3, और एजी- विशिष्ट TCR व्यक्त करने और एजी उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं।इस पद्धति को सफलतापूर्वक एक murine मॉडल में स्व-प्रतिरक्षित गठिया के सेल आधारित चिकित्सा करने के लिए लागू किया गया है। एजी प्रेरित गठिया (एआईए) -bearing चूहों में इन एजी-विशिष्ट IPSC-Tregs के दत्तक हस्तांतरण संयुक्त सूजन को कम करने और सूजन और हड्डी हानि को रोकने के लिए की क्षमता है।
Autoimmune arthritis is a systemic disease characterized by hyperplasia of synovial tissue and progressive destruction of articular cartilage, bone, and ligaments1. The defective generation or function of Tregs in autoimmune arthritis contributes to chronic inflammation and tissue injury because Tregs play a crucial role in preventing the development of auto-reactive immune cells.
Manipulation of Tregs is an ideal strategy for the development of therapies to suppress inflammation in an Ag-dependent manner. For Treg-based immunotherapy, the specificity of the transferred Tregs is important for the treatment of ongoing autoimmunity2. To exhibit the suppressive activity, Tregs need to migrate and be retained at the afflicted region, which can be directed by the specificity of the TCR for the Ag at that location3. Although polyclonal Tregs may contain a small population containing this Ag specificity from their TCRs, the numbers of these Ag-specific Tregs are usually low. Consequently, cell-based therapies using polyclonal Tregs against autoimmune disorders require adoptive transfers of a large number of Tregs4,5. Because pluripotent stem cells (PSCs) have the ability to develop into any type of cell, Ag-specific PSC-Tregs may prove to be good candidates for Treg-based immunotherapy. Previous studies have shown the successful development of PSC-derived T cells, including Tregs6-8.
Here, we describe a protocol to develop Ag-specific iPSC-Tregs. We further describe a cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model using such Tregs. This method is based upon genetically modifying murine iPSCs with Ag-specific TCRs and the transcriptional factor FoxP3. The engineered iPSCs then differentiate into Ag-specific Tregs on the OP9 stromal cells expressing Notch ligands DL1, DL4, and MHC-II (I-Ab) molecules in the presence of cytokines mFlt3L and mIL-7. These Ag-specific iPSC-Tregs can produce suppressive cytokines, such as TGF-β and IL-10, when stimulated with the Ag, and adoptive transfer of such Tregs has the ability to suppress AIA development in a murine model. The described protocol can be used to develop stem cell-derived Ag-specific Tregs for potential therapeutic interventions.
इस प्रोटोकॉल में, एक महत्वपूर्ण कदम TCR / Foxp3 जीन-transduced IPSCs की इन विट्रो भेदभाव है। इन विट्रो पायदान संकेतन टी सेल वंश की दिशा में विकास लाती है। सीडी 4 + Foxp3 + Tregs में IPSCs अंतर करने के लिए, हम OP9-DL1 / DL4 / आइए ?…
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना के हिस्से में वित्त पोषित किया गया, स्वास्थ्य (R01AI121180, R21AI109239 और K18CA151798), अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान के तहत (1-16-IBS-281), और स्वास्थ्य के पेंसिल्वेनिया विभाग (तम्बाकू निपटान फंड) के लिए जेएस
C57BL/6j mice | Jackson Laboratory | 664 | |
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J | Jackson Laboratory | 2216 | |
Anti-CD3 (2C11) antibody | BD Pharmingen | 553058 | |
Anti-CD28 (37.51) antibody | BD Pharmingen | 553295 | |
Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100417 | |
Anti-CD8 (53–6.7) antibody | Biolegend | 100714 | |
Anti-CD25 (3C7) antibody | Biolegend | 101912 | |
Anti-TCR-β (H57597) antibody | Biolegend | 109220 | |
Anti-IL10 | Biolegend | 505010 | |
Anti-TGFβ | Biolegend | 141402 | |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
Polybrene | Sigma | 107689 | |
Genejammer | Integrated science | 204130 | |
ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
mFlt-3L | peprotech | 250-31L | |
mIL-7 | peprotech | 217-17 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
mBSA | Sigma | A7906 | |
Ova albumin | Avantor | 0440-01 | |
CFA | Difco | 2017014 | |
Tailveiner restrainer | Braintree scientific | RTV 150-STD |