Her presenterer vi en protokoll for å kvantifisere allergen-lastet partikler ved flowcytometri. Ambient svevestøvpartikler kan virke som bærere av adsorberte allergener. Vi viser her at flowcytometri, en metode som er mye brukt for å karakterisere suspenderte faste stoffer> 0,5 pm i diameter, kan anvendes for å måle disse allergen belastede partikler.
Strømningscytometri er en metode som er mye brukt for å kvantifisere suspenderte faste stoffer slik som celler eller bakterier i et størrelsesområde fra 0,5 til flere titalls mikrometer i diameter. I tillegg til en karakterisering av forover og sideveis strø egenskaper, gjør det mulig å bruke fluorescerende merkede markører som antistoffer for å detektere respektive strukturer. Ved hjelp av indirekte antistoff farging, flowcytometri er ansatt her for å kvantifisere bjørkepollen allergen (presist Bet v 1) -loaded partikler på 0,5 til 10 mm i diameter i inhalerbar svevestøv (PM10, partikkelstørrelse ≤10 mikrometer i diameter). PM10 partikler kan virke som bærere av adsorberte allergener eventuelt transportere dem til de nedre luftveier, hvor de kunne utløse allergiske reaksjoner.
Så langt allergenet innholdet av PM10 er blitt studert ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og scanning elektronmikroskopi. ELISA måler oppløst og ikke partikkel-bundet allergen. Sammenlignet med scanning elektronmikroskopi, som kan visualisere allergen-lastet partikler, flowcytometri kan i tillegg tallfeste dem. Som allergen innholdet i luften kan avvike fra bjørk pollen teller, kan allergiske symptomer kanskje samsvarer bedre med allergen eksponering enn med pollen teller. I forbindelse med kliniske data, gir den presenterte fremgangsmåten muligheten til å teste i senere eksperimenter om allergiske reaksjoner mot bjørkepollen antigener blir assosiert med Bet v 1 allergen innhold av PM10 partikler> 0,5 um.
Luftforurensning blir ansett som en viktig miljø årsak til økt forekomst og alvorlighetsgrad av luftveisallergier observert de siste tiårene 1-3. Dessuten var det en økende interesse i fordelingen av vanlige allergener i støv 4,5.
Bjørkepollen kan provosere høysnue, men kan også være en viktig årsak til allergisk astma 6-8. Hele bjørkepollen er ikke sannsynlig å gå inn i nedre luftveier eller som befinner seg i PM10 som et resultat av sin størrelse (22 mikrometer i diameter). Imidlertid kan bjørk pollen allergener som Bet v 1, de store bjørkepollen allergen komponent, bli løslatt etter pollen ruptur 9 og kan binde seg til omgivende luft partikler 10, og dermed muligens inn nedre luftveiene. Faktisk har det vist seg at PM10 kan inneholde biologisk aktive allergener som demonstrert ved in vitro-aktivering av basophiles fra et pollen allergisk proband 11 </sup>.
Bet v 1 allergen innhold i PM10 prøver har blitt undersøkt ved å ekstrahere det aktuelle allergen og påfølgende kvantifisering med ELISA 12-14. Med ELISA-teknikk, ble det oppløst genet måles, men mengden av allergen belastede partikler forble ukjent. Scanning elektronmikroskopi avslørte allergen-lastet partikler, men ikke tillater kvantifisering 10,15.
Denne studien benytter flowcytometri å kvantifisere andelen av Bet v 1-lastet PM10-partikler i omgivelsesluftprøver. På grunn av den påvisningsgrensen for strømningscytometer eneste partikler som er større enn 0,5 pm kan bli undersøkt. Den> 0,5 um fraksjon av PM10 vil bli ytterligere referert til som PM10> 0,5.
Et kritisk trinn i protokollen er bruken av et passende filter for oppsamling av partikler fra PM10 omgivende luft (se trinn 1.1). Filteret må være sterk nok til å tåle børsting med en elektrisk tannbørste, og ikke alle filtermaterialer oppfyller dette kravet. Fargingen protokollen ble etablert med en PM10 partikkelkonsentrasjon på 8×10 6 partikler per ml. Men hvis materialet er begrenset og samkjøring av prøvene er ikke hensiktsmessig, vil metoden sannsynligvis fungere også, men antistoffkonsentrasjoner (se trinn 3.5 og 3.8) kanskje må justeres.
Bet v 1-farging av PM10 partikler resulterte ikke i distinkte populasjoner av positivt og negativt fargede partikler. Dette kan være forårsaket av varierende mengder av Bet v 1 allergen adsorbert til hver av de partikler som varierer fra meget lite opp til en høy verdi. Dette kan føre til utvidelse av APC signal dermed skiftende befolkningen motAPC positivitet. Ettersom det er vanskelig å separere den positive fra de negative partikler ble to kvantifisering metoder som brukes for å bestemme forskjellene i Bet v 1-innholdet i PM10> 0.5 prøver: (i) i forhold kvantifisering ved å måle den midlere APC fluorescensintensiteten av alle partikler og (ii) å bestemme prosentandelen av APC positive partikler. Når det gjelder Bet v 1 belastning av partikler fra lav og høy pollensesongen PM10> 0,5, begge metodene avslørt lignende resultater. Likevel er relativ kvantifisering av midlere fluorescensintensitet av alle partikler anbefales som det er uavhengig av å plassere porten og derfor sannsynligvis mindre utsatt for feil.
Til dags dato mange studier undersøke allergen innholdet i luften svevestøv ved å trekke den respektive allergen og påfølgende kvantifisering med ELISA 5,12-14,17. Det er en fundamental forskjell mellom fremgangsmåten som er beskrevet her og den quantification med ELISA: ELISA kvantifiserer det ekstraherte og oppløste antigen, mens flowcytometri analyserer partikkel-bundne antigen. Ved hjelp av ELISA Bet v en belastning av de testede prøvene PM10 (n = 8) var under påvisningsgrensen på 1,2 ng / ml (data ikke vist). Tilsvarende Buters og andre identifiserte ikke Bet v 1 i PM <2,5 um fraksjon og bare omkring 7% i den 10 um> PM> 2,5 um fraksjon, men mer enn 93% i PM> 10 um fraksjon av omgivende luft 13. Kontraster Resultatene av ELISA på den ene side og FACS-analyse på den annen side, kan være forårsaket av forskjeller i påvisningsfremgangsmåten i forbindelse med avvikende følsomhet. Videre forskning er imidlertid nødvendig for å fullt ut forstå denne forskjellen.
En fremgangsmåte for å visualisere partikkel-bundne antigen er scanning-elektronmikroskope 10,14. Ved scanning-elektronmikroskopi, Ormstad et al. Visualisert Bet v 1 på overflaten av suspendert partikkelformet matter sotpartikler samplet i høy pollensesongen og i mindre grad på partiklene samplet i lav pollensesongen 15. I tillegg ble allergener fra pollen, lateks og også p-glukaner funnet å adsorberes til forbrennings partikler i omgivelsesluften 10. Denne metode er imidlertid ikke tillater kvantifisering av partikkel-bundne allergen.
Ved bruk av flowcytometri, kan partikkelbundet Bet v 1 genet kvantifiseres. Således flowcytometri kan tilby en ny måte for å karakterisere 10 til 0,5 pm biologisk fraksjon av PM10 som med andre egnede antistoffer for hånden, kan denne metoden bli utvidet til påvisning av andre antigener av omgivelsesluftpartikler, for eksempel, mugg, støv midd allergener eller LPS. Som PM10-partikler absorberer ikke bare biologisk materiale, men også kjemikalier og metaller ganske lett, uspesifikk binding av antistoffer kan imidlertid utgjøre et problem. Dersom et nytt antistoff som er testet, er et kritisk trinn for å påvise spesifikk bindingsing. Dette kan gjøres ved for eksempel å blokkere bindingskapasiteten av det spesifikke antistoff med det tilsvarende antigen før farging 11.
Som Bet v 1 innholdet i luften kan avvike fra bjørkepollen teller 12,13,18, kan allergiske symptomer kanskje samsvarer bedre med allergen nivå enn med pollen teller 14,18. Derfor presenterte metoden i forbindelse med kliniske data gjør det mulig å undersøke i fremtidige eksperimenter om allergiske reaksjoner på bjørk tilsvare Bet v 1 allergen belastningen av PM10> 0,5.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.
Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/h |
Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55mm, H 15mm |
FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5ml Polystyrene |
CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1,4 ml, PP |
Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |