Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporciona detalles de la organización celular y ultraestructura. Sin embargo, el análisis de TEM de las poblaciones de células raras, especialmente células en suspensión, tales como células madre hematopoyéticas (HSC), sigue siendo limitada debido a la exigencia de un número de células de alta durante la preparación de la muestra. Hay algunos enfoques Cytospin o monocapa para el análisis TEM de las muestras de los escasos, pero estos enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativos a partir del número limitado de células. Aquí, se describe un enfoque alternativo y novedoso para la preparación de muestras en los estudios TEM para poblaciones de células raras que permite el análisis cuantitativo.
Un número relativamente bajo de células, es decir, 10.000 HSC, se utilizó con éxito para el análisis de TEM en comparación con los millones de células utilizadas normalmente para estudios de TEM. En particular, la tinción de azul de Evans se realizó después de paraformaldehído-glutaraldehído fijación (PFA-GA) para visualizar la pequeña pel celulardejar, lo que facilitó la incorporación de agarosa. No se observaron agrupaciones de numerosas células en cortes ultrafinos. Las células tenían una morfología bien conservada, y los detalles ultra-estructurales de la mitocondria complejos y varios de Golgi eran visibles. Este protocolo eficiente, fácil y reproducible permite la preparación de muestras de un número bajo de células y se puede utilizar para el análisis TEM cualitativa y cuantitativa sobre las poblaciones de células raras de muestras biológicas limitados.
Introduction
Detalles-Ultra estructurales y sub-orgánulos de células se han puesto de manifiesto principalmente por microscopía electrónica de transmisión (TEM) estudios de tejidos o sedimentos celulares 1,2. piezas sólidas de tejidos se pueden utilizar fácilmente para estudios de microscopía electrónica. Sin embargo, los análisis de TEM 1,3 en las células en suspensión siguen siendo difíciles y requieren altos números de células, es decir, millones de células. Debido a esto, los análisis ultra-estructurales de las poblaciones de células raras en suspensión, por ejemplo, células madre hematopoyéticas (HSC), no son evaluados fácilmente. Múltiples intentos para el análisis de TEM de las muestras de los escasos utilizando cytospin o monocapa enfoques no pueden conseguir datos cuantitativos significativa del número limitado de células. Por lo tanto, el requisito de un número alto de células limita el uso de esta potente herramienta para entender los detalles ultraestructurales subcelulares de las poblaciones de células raras.
Una limitación clave para los estudios TEM con un número limitado de célulass en suspensión es la localización de las células para el procesamiento y, por tanto, los estudios de TEM de las células limitadas con particular tamaños pequeños siguen siendo difíciles. Varios enfoques alternativos se han adoptado para hacer frente a esta limitación: la BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerización mediada por la suspensión celular, la tinción de las células con un tinte para que sean visibles en un soporte de película delgada incluyendo cubreobjetos, y análisis TEM de las preparaciones de citospina 4-6. Sin embargo, se logró un éxito muy limitado, como se encontraron muy pocas células en secciones después de ultra-seccionamiento. El desafío clave de identificación de células dispersas persiste debido a la monocapa de células se mantiene prácticamente invisible en el gel solidificado para seccionar. Además, la preparación de citospina de células puede alterar su organización celular debido a la propagación de células y la fragilidad de la estructura celular. Por lo tanto, estos inconvenientes inherentes justifican un enfoque novedoso para llevar a cabo estudios de TEM de las poblaciones de células raras con másconsistencia. Para superar este problema, hemos descrito un método nuevo y preparación de la muestra alternativa para los estudios de TEM de las poblaciones de células raras 7.
Aquí, se presenta un protocolo de preparación de muestras eficiente para llevar a cabo TEM de las muestras biológicas con escasos resultados cualitativos y cuantitativos consistentes. Evans tinción con azul se llevó a cabo después de la fijación para localizar un pequeño sedimento celular a partir de células de bajo número, es decir, 10.000 médula ósea madre hematopoyéticas y células progenitoras que de otro modo habrían permanecido invisible, y el sedimento se incrusta en agarosa antes de procesos de deshidratación y de la resina de inclusión. Este método agrupa las células juntos y permite el análisis eficaz de la ultraestructura y organización subcelular de las células madre hematopoyéticas (identificado como Lin – Sca-1 + c-Kit + Flt3 – CD34 -; HSC), una rara 0,2 – población de células 0,5% en la médula ósea. Este pro experimentaltocol puede ser útil para llevar a cabo estudios de ultra-estructurales y obtener resultados cuantitativos en muchas poblaciones raras pero altamente importantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método permite el análisis TEM de bajo número de células, mediante el uso de la tinción de azul de Evans y la incrustación de agarosa para localizar un pequeño sedimento celular durante la deshidratación, la incrustación de resina y los procesos de corte. Es importante destacar, que mantiene juntos los grupos de células y preserva la ultra-estructura de la célula, que es deseable para examinar células múltiples para la cuantificación de datos.
En estudios TEM, a menudo se …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
Riferimenti
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