Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz
Summary
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Es gibt mehr als 70 Millionen Hunde allein in den USA 1. Wie bewertet Familienmitglieder, oft sind diese Tiere erhalten Schneiden medizinische Versorgung Rand. Ebenso , weil sie unsere Umwelt teilen, können Hunde geben Einblicke in die Pathogenese und Behandlung menschlicher Krankheiten 1. Doch ob Entdeckungen in der Humanmedizin in tierärztliche Behandlungen oder umgekehrt zu übersetzen, ist es wichtig, gründlich Spezies Variationen charakterisieren auch in hochkonservierten Systeme wie die angeborene Immunantwort. Beispiele für Unterschiede zwischen dem Eckzahn und menschlichen angeborenen Immunsystems sind die hohe Expression CD4 auf Hund Neutrophilen 2; das Fehlen eines funktionellen Homolog des zytoplasmatischen Flagellin Sensor IPAF in dogs 3 und die Expression eines Caspase 1/4 Hybrid in Fleischfressern 4.
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind eine relativ kürzlich entdeckte Komponente der angeborenen Immunität 5. NETs sind Netzwerks von DNA, nukleare und granular Proteine in Reaktion auf eine Vielzahl von entzündlichen oder infektiösen Reizen 6 freigegeben. Netzartige Strukturen wurden in vielen Spezies , einschließlich Hühner 7 gezeigt Fisch 8, 9 und Mollusken acoelomates 10, aber es gibt Speziesvariationen. Zum Beispiel reagieren Maus – Neutrophilen langsamer NETosis Stimuli als menschliche Neutrophilen und bilden weniger diffuse NETs 11. Es gibt einen großen Körper von Beweismitteln aus mehreren Arten , die NETs entrap Mikroben und umstrittener direkt bei der Abtötung von Krankheitserregern 12,13 beteiligt sein können. NET – Komponenten auch Gewebeschäden jedoch verbessern, Thrombose und Tat fördern als 14,15 Autoantigene. Die Balance zwischen den nützlichen und schädlichen Wirkungen von NETs können zwischen verschiedenen Krankheiten und verschiedenen Arten variieren, was darauf hindeutet, ist es wichtig, NETs zu untersuchen, sowohl in der Art und Zustand von Interesse.
Hier sind wirbeschreiben ein einfaches Protokoll für die Induktion und die Freisetzung von NETs durch Hunde- Neutrophilen zu messen. Dieses Verfahren ist ähnlich zu denjenigen verwendet , um Neutrophile 16 und induzieren NETosis in anderen Arten, aber die Bedingungen , wie beispielsweise Agonist – Konzentration und Inkubationszeit isolieren haben canine Neutrophilen optimiert. Eine ähnliche NET Quantifizierung DNA – Freisetzungstest wurde auch bei anderen Spezies beschrieben worden , aber das hier vorgestellte Verfahren ist auch für Hunde 8,17,18 optimiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die DNA-Freisetzungstest vorgestellt, ist ein leicht quantifizierbare Assay für die extrazelluläre DNA. Die Methode wurde von ähnlichen Techniken angepasst verwendeten NET Bildung in anderen Spezies zu bewerten, aber Zentrifugation Geschwindigkeiten Agonist – Konzentrationen und Inkubationszeiten verändert wurden 8,17,18 das Verfahren zur Verwendung mit canine Neutrophilen zu optimieren. Ähnliche Anpassungen könnten die Verfahren für andere Arten angepasst werden. Der Test ist einfach und kostengünsti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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