Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita

Summary

trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine ​​neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.

Abstract

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Introduction

Ci sono oltre 70 milioni di cani negli Stati Uniti da solo ^1. Come membri della famiglia stimati, questi animali spesso ricevono cure mediche taglio bordo. Altrettanto perché condividono il nostro ambiente, i cani possono fornire intuizioni nella patogenesi e nel trattamento delle malattie umane ^1. Tuttavia, se traducendo scoperte in medicina umana in trattamenti veterinari o viceversa, è importante caratterizzare accuratamente variazioni specie anche in sistemi altamente conservati quali la risposta immunitaria innata. Esempi di differenze tra il cane e il sistema immunitario innato umano includono l'alta espressione CD4 sui neutrofili cane ^2; l'assenza di un omologo funzionale del sensore flagellin citoplasmatica IPAF nei cani ³ e l'espressione di un ibrido caspasi 1/4 carnivori ^4.

Trappole extracellulari dei neutrofili (reti) sono una componente relativamente recente scoperta di immunità innata ^5. Le reti sono di retes del DNA, proteine nucleari e granulari rilasciati in risposta ad una vasta gamma di stimoli infiammatori o infettive ^6. Strutture a rete sono state dimostrate in molte specie tra cui polli ^7, pesce, molluschi ^{8 9} e acoelomates ^10, ma ci sono variazioni di specie. Ad esempio, i neutrofili murini rispondono più lentamente agli stimoli NETosis di neutrofili umani, e formano NET meno diffuse ^11. Vi è un grande corpo di evidenze provenienti da più specie che NET intrappolano i microbi, e più controverso può essere direttamente coinvolti nell'uccisione di agenti patogeni ^12,13. Tuttavia, i componenti NET anche migliorare danni ai tessuti, favoriscono la trombosi e di agire come autoantigeni ^14,15. L'equilibrio tra i benefici effetti deleteri e di reti può variare tra diverse malattie e specie diverse, suggerendo è importante indagare NET sia nelle specie e condizioni di interesse.

Qui noidescrivere un semplice protocollo per indurre e misurando il rilascio di NET da parte dei neutrofili canina. Questo metodo è simile a quelli usati per isolare neutrofili ¹⁶ ed indurre NETosis in altre specie, ma le condizioni quali la concentrazione agonista e tempo di incubazione sono state ottimizzate per i neutrofili canino. Un saggio di rilascio quantificazione del DNA NET simile è stata descritta anche in altre specie, ma il metodo presentato qui è anche ottimizzato per i cani ^8,17,18.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con il permesso etico da parte del Comitato Istituzionale dell'Università cura degli animali e Usa Iowa State. Raccolta 1. Sangue Disegnare 9 ml di sangue da una safena, la vena cefalica o giugulare direttamente in anticoagulante (ad esempio, l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml di sangue) vacutainer, o in una siringa con il trasferimento immediato di provette di sangue EDTA contenenti. Delicatamente roto…

Representative Results

Usando questo protocollo, dovrebbe esserci una forte variazione piega in fluorescenza dopo stimolazione neutrofili con i controlli positivi, PMA e PAF. Come illustrato nella Figura 1B, la stimolazione dei neutrofili canino con 31 pM PAF per 1 hr, comportano un aumento medio di 4,0 volte della fluorescenza rispetto alle cellule non stimolate (range 2,0-5,8, n = 5 cani) 18. PMA a 0,1 micron (Figura 1A) è un agonista più lento che non si traduc…

Discussion

Il saggio di rilascio del DNA presentato è un test facilmente quantificabile per il DNA extracellulare. Il metodo è stato adattato da tecniche simili utilizzati per valutare la formazione di NET in altre specie, ma la velocità di centrifugazione, le concentrazioni di agonisti e tempi di incubazione sono state modificate per ottimizzare il metodo per l'utilizzo con i neutrofili canini ^8,17,18. regolazioni simili potrebbero essere fatte per adattare il metodo per le altre specie. Il test è semplice e po…

Materials

Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA