イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ
Summary
好中球細胞外トラップ（ネット）DNA、ヒストンおよび好中球のタンパク質のネットワークです。先天性免疫応答の成分が、ネットは自己免疫および血栓症に関与しています。このプロトコルは、イヌ好中球の単離およびマイクロプレート蛍光アッセイを用いてのNETの定量化のための単純な方法を記載しています。
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
米国だけ1万人の70以上のペットの犬があります。大切な家族のように、これらの動物は、多くの場合、エッジ医療を切断受けます。彼らは私たちの環境を等しく共有しているため、犬は人間の病気1の病因と治療への洞察を提供することができます。しかし、獣医学的治療またはその逆に人間の医学の発見を翻訳するかどうか、徹底的にあっても、そのような先天性免疫応答のような高度に保存されたシステムでは、種のバリエーションを特徴づけることが重要です。イヌとヒトの先天性免疫系の間の違いの例としては、犬の好中球2に高発現CD4を含みます。犬3と肉食4におけるカスパーゼ1/4ハイブリッドの発現の細胞質フラジェリンセンサーIPAFの機能的ホモログが存在しません。
好中球細胞外トラップ（ネット）、先天性免疫5の比較的最近発見されたコンポーネントです。ネットネットワークであります炎症性または感染性の刺激6の広い範囲に対応して放出されたDNA、核および粒状タンパク質の秒。 NETのような構造は、ニワトリ7、魚8、軟体動物9および10を acoelomates含む多くの種を越えて実証されているが、種のバリエーションがあります。例えば、マウス好中球は、ヒト好中球よりNETosisの刺激に応答速度が遅く、少ない拡散のNET 11を形成します 。ネットは直接病原体12,13を殺害に関与している可能性がより多くの論争の微生物を捕捉し、複数の種からの多くの証拠があります。しかし、NETコンポーネントはまた、組織の損傷を高める14,15を自己抗原として血栓症や行動を推進しています。 NETの有益と有害な影響のバランスは、種と関心の状態の両方でネットを調査することが重要である示唆し、異なる疾患と異なる種の間で異なる場合があります。
ここでイヌの好中球によるのNETの放出を誘導し、測定するための単純なプロトコルを記述します。この方法は、好中球16を分離し、他の種にNETosisを誘導するために使用されるものと同様であるが、そのようなアゴニスト濃度およびインキュベーション時間などの条件は、イヌ好中球のために最適化されています。同様のNET定量DNA放出アッセイは、他の種に記載されているが、ここで提示された方法はまた、イヌ8,17,18のために最適化されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたDNA放出アッセイは、細胞外DNAのために容易に定量化できるアッセイです。この方法は、同様の他の種でNET形成を評価するために使用される技術が、遠心分離速度、アゴニスト濃度から適応され、インキュベーション時間は、イヌ好中球8,17,18で使用するための方法を最適化するために変更されています。同様の調整は、他の種のための方法を適合させることができます。こ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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