Простой флуоресценция Анализ на Количественное Собачий Нейтрофильная внеклеточной Trap Release
Summary
Нейтрофильных внеклеточные ловушки (НРТ) представляют собой сети ДНК, гистонов и нейтрофильных белков. Хотя компонент врожденного иммунного ответа, Сетки замешан в аутоиммунной реакции и тромбоза. Этот протокол описывает простой метод собачьего выделения нейтрофилов и количественного НЭО с использованием анализа микропланшет флуоресценции.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Есть более 70 миллионов домашних собак только в США 1. Как уважаемых членов семьи, эти животные часто получают ультрасовременную медицинскую помощь. В равной степени , потому что они разделяют нашу окружающую среду, собаки могут дать представление о патогенезе и лечении заболеваний человека 1. Тем не менее, является ли перевод открытий в медицине человека в ветеринарным обработкам, или наоборот, важно тщательно охарактеризовать его видовые разновидности, даже в высоко консервативны системах, таких, как врожденной иммунной реакции. Примеры различий между клыка и врожденной иммунной системы человека , включают в себя высокий уровень экспрессии CD4 на собачьих нейтрофилы 2; отсутствие функционального гомолога цитоплазматической датчика флагеллином IPAF у собак 3 и экспрессия каспазы 1/4 гибрид в плотоядным 4.
Нейтрофильных внеклеточные ловушки (НРТ) являются сравнительно недавно обнаруженный компонент врожденного иммунитета 5. Сетки сетьс ДНК, ядерные и гранулированных белки , высвобождаемые в ответ на широкий круг воспалительного или инфекционного раздражители 6. NET-подобные структуры были продемонстрированы во многих видов , включая кур 7, 8 рыб, моллюсков 9 и acoelomates 10, но существуют различия видов. Например, мышиные нейтрофилы реагируют более медленно , чем NETosis раздражители нейтрофилов человека, и образуют диффузные менее 11 сетей не . Существует большое количество доказательств из нескольких видов , которые НРТ взбитых микробов, и более спорно , могут быть непосредственно вовлечены в убийство патогены 12,13. Тем не менее, NET компоненты также увеличивают повреждения тканей, способствуют тромбообразованию и выступать в качестве аутоантигенов 14,15. Баланс между желательными и пагубные последствия сеток может варьироваться от различных заболеваний и различных видов, предполагая, что важно исследовать как в сетей не от вида и состояния интереса.
Мы тутописывают простой протокол для индукции и измерения высвобождения НЭО на собачьих нейтрофилов. Этот метод аналогичен тем , которые используются для изоляции нейтрофилы 16 и индуцируют NETosis у других видов, но условия , такие как повышенная концентрация агониста и времени инкубации были оптимизированы для собачьих нейтрофилах. Похожая NET анализа высвобождения Количественное ДНК также была описана у других видов , но метод , представленный здесь также оптимизирован для собак 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ ДНК-релиз представлен представляет собой легко поддаются количественной оценке для анализа внеклеточной ДНК. Этот метод был адаптирован из подобных методов , используемых для оценки NET формирование у других видов, но скорость центрифугирования агонист концентрации и времени и…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
Riferimenti
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?. Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
