Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento
Summary
trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Hay más de 70 millones de perros en los EE.UU. solamente 1. Como miembros de la familia valorados, estos animales a menudo reciben la atención médica de corte borde. Del mismo modo, ya que comparten nuestro medio ambiente, los perros pueden ayudar a comprender la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades humanas 1. Sin embargo, si la traducción de los descubrimientos en la medicina humana en tratamientos veterinarios o viceversa, es importante para caracterizar completamente las variaciones de especies incluso en sistemas altamente conservadas tales como la respuesta inmune innata. Ejemplos de diferencias entre el canino y el sistema inmune innato humano incluyen una alta expresión de CD4 en perros neutrófilos 2; la ausencia de un homólogo funcional del sensor flagelina citoplásmica IPAF en perros 3 y la expresión de un híbrido de la caspasa 1/4 en los carnívoros 4.
Trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son un componente relativamente reciente descubrimiento de la inmunidad innata 5. Las redes son la reds de ADN, las proteínas nucleares y granulares libera en respuesta a una amplia gama de estímulos inflamatorios o infecciosos 6. Estructuras en forma de red se han demostrado en muchas especies incluyendo pollos 7, peces, moluscos 8 9 y 10 acoelomates, pero hay variaciones de especies. Por ejemplo, los neutrófilos murinos responden más lentamente a los estímulos NETosis que los neutrófilos humanos, y forman TNE menos difusas 11. Hay una gran cantidad de evidencia de múltiples especies que las redes atrapan los microbios, y más polémica puede estar directamente involucrados en la eliminación de patógenos 12,13. Sin embargo, los componentes de red también aumentan el daño tisular, promueven la trombosis y actúan como autoantígenos 14,15. El equilibrio entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de redes pueden variar entre diferentes enfermedades y las diferentes especies, lo que sugiere que es importante investigar TNE tanto en la especie y condición de interés.
Aquí nosotrosdescribir un protocolo sencillo para inducir y medir la liberación de los TNE por los neutrófilos caninos. Este método es similar a los utilizados para aislar los neutrófilos 16 e inducir NETosis en otras especies, pero las condiciones tales como la concentración de agonista y tiempo de incubación han sido optimizados para los neutrófilos caninos. Un ensayo de liberación de ADN cuantificación NET similares también se ha descrito en otras especies, pero el método que aquí se presenta también está optimizado para perros 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de liberación de ADN presentada es un ensayo fácilmente cuantificables para el ADN extracelular. El método fue adaptado de técnicas similares que se utilizan para evaluar la formación neta de otras especies, pero la velocidad de centrifugación, las concentraciones de agonistas y los tiempos de incubación han sido alterados para optimizar el método para su uso con los neutrófilos caninos 8,17,18. ajustes similares podrían hacerse para adaptar el método para otras especies. El ensayo es sen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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