Un modèle de pince hilaire de foie de rat unique a été développé pour étudier l'impact des molécules pharmacologiques dans l'amélioration ischémie-reperfusion. Ce modèle comprend la canulation directe de la fourniture de portail au segment hépatique ischémique via une branche de la veine porte, permettant une livraison directe hépatique.
Major chirurgie hépatique avec occlusion d'entrée et une transplantation hépatique, nécessite une période d'ischémie chaude, et une période de reperfusion conduisant à une ischémie / reperfusion (I / R) des blessures avec des conséquences négatives multiples. Potentiel blessure I / R dans les organes marginaux destinés à la transplantation du foie contribue à la pénurie de donneurs courant secondaire à un taux d'utilisation d'organes a diminué. Un besoin important existe pour explorer des blessures I / R hépatique afin de médier son impact sur la fonction du greffon dans la transplantation. foie de rat modèles de serrage hile sont utilisés pour étudier l'impact des différentes molécules sur les blessures I / R hépatique. Selon le modèle, ces molécules ont été livrées en utilisant l'inhalation, la perfusion péridurale, injection intra-péritonéale, l'administration ou l'injection intraveineuse dans la veine mésentérique supérieure périphérique. Un foie de rat modèle de pince hilaire a été développé pour être utilisé dans l'étude de l'impact des molécules pharmacologiques dans l'amélioration des blessures I / R. le described modèle de pince hilaire de foie de rat comprend canulation directe de la fourniture de portail au segment hépatique ischémique par l'intermédiaire d'une branche latérale de la veine porte, permettant une livraison hépatique segmentaire direct. Notre approche est d'induire une ischémie dans les lobes latéraux et médians gauche pendant 60 minutes, au cours de laquelle la substance à l'étude est infusé. Dans ce cas, pégylée-superoxyde dismutase (SOD PEG-), un capteur de radicaux libres, est perfusée directement dans le segment ischémique. Cette série d'expériences démontre que la perfusion de PEG-SOD est de protection contre les blessures I / R hépatique. Les avantages de cette approche comprennent l'injection directe de la molécule dans le segment ischémique avec une diminution conséquente du volume de distribution et à la réduction des effets secondaires systémiques.
Major chirurgie hépatique avec occlusion d'entrée et une transplantation hépatique, nécessite une période d'ischémie chaude, et une période de reperfusion conduisant à une ischémie / reperfusion (I / R) 1 blessure. Les conséquences de blessures I / R dans le foie ont été détaillées largement 1, 2, 3. Les conséquences de I / blessure R détaillée dans la littérature comprennent: la génération d'espèces réactives de l'oxygène, l'initiation de la cascade inflammatoire, y compris l'activation des neutrophiles, des cellules de Kupffer et les cellules endotheliales, l'activation du système d'hème oxygénase et de l'activation des récepteurs de type Toll, un déséquilibre entre l' endothéline et de l' oxyde nitrique, l' activation du facteur nucléaire-kB, et la promotion des cytokines pro – inflammatoires et des molécules d'adhésion synthèse 1, 2, 3. Ces événements peuvent l proinflammatoiresead à l' apoptose, la nécrose, la dysfonction d'organes et de défaillance d' un organe éventuel 3.
I / R blessures dans les organes destinés à une transplantation hépatique peut conduire à la perte précoce de la greffe et contribue à la pénurie actuelle des donateurs comme des organes marginaux sont plus sensibles aux blessures 3. Il y a actuellement 15,226 bénéficiaires potentiels sur la liste d' attente pour une transplantation du foie aux États-Unis 4 et seulement 5950 transplantations hépatiques ont été réalisées en 2015 5. En raison de cette limitation extrême disponibilité des organes, la recherche exploration des blessures I / R hépatique est nécessaire afin d'optimiser la fonction du greffon et de l'utilisation d'organes.
Les modèles animaux utilisés pour étudier les blessures I / R hépatique comprennent des modèles de serrage de rat hilaire et modèles de transplantation de foie de rat. Il existe une variété de modèles de serrage de hile de rat actuellement en cours d'utilisation. Le plus courant est celui dans lequel la veine porte, l'artère hépatique et biliaire duct à fournir les lobes latéraux et médians de gauche sont serrées au moyen de clips de microchirurgie 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 pendant 30 à 60 min 6, 7, 10, 13, 14, puis une période de reperfusion de 60 min à 24 h 7, 9, 10, 13, 14 est autorisé. Les lobes latéraux et médian gauche du foie de rat représentent environ 70% du parenchyme hépatique 9. Certains protocoles destinés à l'étude préconditionnement ischémique comprennent serrage intermittente des vaisseaux hilairesou le membre postérieur avant une période d'ischémie induite par serrage plus les vaisseaux hilaires 9, 13. Il y a aussi plusieurs modifications décrites dans la littérature. La première consiste à serrer la veine porte et l' artère hépatique fournir les lobes latéraux et médian gauche, mais exclure la voie biliaire 15. Une deuxième modification est d'induire une ischémie hépatique totale par serrage de la veine porte, l' artère hépatique et des voies biliaires avant leur division 16, 17, 18, 19, 20. Une troisième modification comprend le serrage des pédicule au lobe droit pendant 30 à 60 min 8. Une modification supplémentaire consiste à serrer le faisceau vasculaire dans une patte postérieure afin d'induire une lésion du foie 13, 21 </sup>. Diverses approches de la procédure de serrage hilaire sont illustrés sur la figure 1A-D.
foie de rat modèles de serrage hile ont été utilisées pour étudier l'impact des molécules et des composés différents sur I / R hépatique. Selon le modèle utilisé ces molécules ont été livrés à l' aide inhalation 11, infusion péridurale 12, injection intraperitoneale 17, 18, 21, 22, l' administration intraveineuse de 10, 14, 15, 19, 23, 24 ou par injection dans la veine périphérique mésentérique supérieure 8 .
Le modèle de pince hilaire de foie de rat décrit dans ce rapport includes canulation directe de la fourniture de portail au segment ischémique par l' intermédiaire d' une branche latérale de la veine porte (figure 2), ce qui permet une livraison hépatique segmentaire directe de la substance pharmacologique à l'étude. Notre approche est d'induire une ischémie dans les lobes latéraux et médians gauche pendant 60 min, temps pendant lequel une infusion de la substance à l'étude, dans ce cas, dismutase pégylée-dismutase, un piégeur de radicaux libres 25, est perfusée directement dans le segment ischémique . Des échantillons de sang sont prélevés avant l'induction de l'ischémie et à 120 min après la reperfusion. A ce stade, le rat est sacrifié et des échantillons sont prélevés à partir des lobes gauche et médiane. En outre, des échantillons sont prélevés à partir du lobe droit de servir de contrôle interne.
Il existe de nombreux avantages à cette approche. Tout d'abord, quand on peut injecter directement la substance pharmacologique à l'étude dans le segment ischémique o le volumeRépartition de f est très faible en comparaison avec le volume de distribution de l'injection dans la circulation systémique ou la cavité péritonéale. De plus, cette approche réduit, mais ne supprime pas la possibilité d'effets secondaires systémiques.
Cette série d'expériences a montré que l'injection de PEG-SOD dans les lobes gauche et médian conduit à une diminution significative de la libération de ALT, peroxydation lipidique des membranes cellulaires (MDA), et le maintien de glutathion (GSH) par rapport aux témoins (Saline normale ). tissus hépatiques transaminases notamment l'alanine aminotransférase (ALT) sont fixés des marqueurs de lésion hépatocellulaire. La diminution de l'ALT lorsque le lobe gauche est injecté avec du PEG-SOD suggère un effet protecteur du PEG-SOD. L'augmentation des tissus MDA indique une augmentation peroxydation des lipides et est considérée comme un marqueur du stress oxydatif et une lésion tissulaire. La surproduction d'espèces réactives de l' oxygène provoque une augmentation de la production de MDA 26. La réduction significative des tissus MDA dans les lobes gauche et médiane de l'animal lorsqu'il est injecté avec PEG-SOD montre un effet protecteur de PEG-SOD. Ceci est cohérent avec la compréhension actuelle que le PEG-SOD protège les cellules contre les dommagescausée par une réduction partielle des espèces réactives de l' oxygène 27. De plus, en présence d'espèces réactives de l' oxygène, du disulfure de glutathion réduit au glutathion (GSH) 28. Le maintien en GSH dans les lobes gauche et médiane du foie injecté avec du PEG-SOD renforce encore l'effet protecteur du PEG-SOD. En outre, il est démontré que il y a une augmentation de la caspase-3 clivée, un produit de l'apoptose, dans des tissus exposés à une lésion d'ischémie-reperfusion. La diminution de la caspase-3 clivée dans le lobe gauche lorsqu'il est traité avec du PEG-SOD suggère que le PEG-SOD conduit à une diminution de l'apoptose.
La superoxyde dismutase (SOD) est une enzyme essentielle dans la détoxication d'espèces réactives de l'oxygène. L'enzyme catalyse la conversion de deux anions superoxyde en peroxyde d'hydrogène et de l'eau. L'enzyme catalase convertit ensuite le peroxyde d'hydrogène en eau et oxygène, 25 l' achèvement du processus. La demi-vie deSOD native a limité son utilisation dans des modèles expérimentaux jusqu'à ce que le développement de glycol-superoxyde dismutase conjugué polyéthylène (PEG-SOD). Conjugaison de SOD de polyethylene glycol augmente sa demi-vie de 6 min à 14 h. Nguyen et al. démontré sa capacité à réduire la peroxydation des lipides dans l' ischémie hépatique chez un modèle de rat, en utilisant une délivrance systémique 29.
Il existe une variété de modifications possibles de la technique détaillée ici et certains ont déjà été décrits dans la littérature. Selon le modèle utilisé molécules ont été livrés à l' aide inhalation 11, infusion péridurale 12, injection intraperitoneale 17, 18, 21, 22, l' administration intraveineuse de 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 ou par injection dans la veine mésentérique supérieure périphérique 8.
Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole. Le plus important est la canulation de la veine porte. Il faut veiller à ce que le trou découpé dans la veine est pas trop grand. Le tissu est très élastique et le trou agrandira lui-même. Nous vous recommandons de commencer par couper un trou qui est de 0,5 mm avec les ciseaux de microchirurgie. La canule peut être introduite à travers le trou à l'aide d'un instrument, ce qui permet une plus grande souplesse que si la tentative d'exécution de cette partie de la procédure à la main. En outre, tout en alimentant d'abord la canule, il devrait viser directement vers la bifurcation des veines portail gauche et à droite pour éviter piquer un trou dans le mur arrière de la veine. Lorsque la pointe de la canule atteint la bifurcation, il peut alors être introduit dans la veine spécifique gaucheallié. Une fois que la canule est introduite dans la veine porte gauche, qui fournit à la fois les lobes gauche et médiane, sa position peut être confirmée manuellement par le sentiment à l'intérieur de la veine. Sa position peut également être confirmée par l'injection d'une petite quantité de solution saline froide et de voir l'effet sur les segments blanchissement fournis du foie.
Le modèle de pince hilaire du foie chez le rat fournit une plate-forme reproductible et stable pour démontrer une lésion ischémique-reperfusion hépatique. Modèles de serrage hile variables ont été utilisées par les chercheurs d'étudier les effets protecteurs des anti-oxydants et d' autres petites molécules 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Les points de variation comprennent quels sont les navires de serrage ed, lequel segment sont fabriqués ischémique, si oui ou non le canal biliaire est inclus et la durée de la période de reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. En outre, lorsque ce modèle est utilisé pour étudier les effets de l' administration d'une molécule de la voie d'administration est également hétérogène 8, 10, 11,« > 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Il y a plusieurs avantages à l'approche décrite. En premier lieu , la canulation directe de la fourniture de portail au segment ischémique permet une livraison hépatique segmentaire directe de la substance pharmacologique à l'étude. Cela permet l'utilisation des autres lobes des foies comme un contrôle interne. en second lieu, canulation hépatique segmentaire permet un volume de distribution réduit pour la molécule étudiée. Cette approche réduit ainsi le risque d'effets secondaires systémiques la substance est injectée directement dans le segment de foie d'intérêt. canulation directe du segment hépatique permet la substance à délivrer de pré-ischémie, Intra-ischémie ou post-ischémie. Cela permet une étude de l'effet de la molécule à tout moment du cycle de lésions d'ischémie-reperfusion. Avec augmentation de la durée ischémique et le niveau accru de blessures occasion supplémentaire pour étudier la régénération du foie serait disponible.
Il y a aussi quelques limites de cette approche. Le premier est le coût de démarrage. L'achat d'un microscope chirurgical pourrait être un coût de démarrage significatif pour un laboratoire qui ne possède pas déjà un. Cette technique peut être difficile, voire impossible, sans microscope. Le second est le temps d'apprentissage de la courbe. Bien que cette procédure est relativement simple, il nécessite une certaine pratique et il est probable qu'un novice exigera un grand nombre de procédures pour devenir un expert.
En résumé, ce modèle permet une plate-forme reproductible, simple et économique pour étudier les lésions d'ischémie-reperfusion hépatique. Bien que dans le protocole décrit ici polyéthylène gldismutase superoxyde-ycol, un capteur de radicaux libres 25, a été infusé, ce modèle pourrait être utilisé pour insuffler une variété de différentes substances pharmacologiques afin d'évaluer leur impact sur les blessures I / R dans le foie.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Dennis Mathias pour son travail d'illustration. Ce travail a été soutenu par le NIH T32AI 106704-01A1 et le Fonds T. Flesch pour la transplantation d'organes, Perfusion, d'ingénierie et de régénération à l'Ohio State University.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |