En unik rottelever hilar klemme modell ble utviklet for å studere virkningen av farmakologiske molekyler ved forbedring av iskemi-reperfusjonsskade. Denne modellen inkluderer direkte kanylering av portalen tilførselen til den iskemiske leveren segmentet via en gren av portvenen, slik at for direkte hepatisk levering.
Større hepatisk kirurgi med tilsig okklusjon, og levertransplantasjon, nødvendiggjøre en periode av varm ischemi, og en periode med reperfusjon som fører til iskemi / reperfusjon (I / R) skade med utallige negative konsekvenser. Potensiell I / R-skade i marginale organer bestemt for levertransplantasjon bidrar til den aktuelle donor mangel sekundært til en redusert organ utnyttelsesgrad. Et stort behov eksisterer for å utforske hepatisk I / R-skade for å mediere sin virkning på organfunksjon i transplantasjon. Rottelever hilar klem modeller blir brukt til å undersøke effekten av forskjellige molekyler på hepatisk I / R-skade. Avhengig av modellen, har disse molekyler er levert ved hjelp av inhalering, epidural infusjon, intraperitoneal injeksjon, intravenøs injeksjon eller injeksjon i den perifere mesenteriske vene. En rottelever hilar klemme modell er utviklet for bruk i å studere virkningen av farmakologiske molekyler i lindring av I / R-skade. den described modell for rottelever hilar Klemmen innbefatter direkte kanylering av portalen tilførselen til den iskemiske hepatisk segmentet via en sidegren av portvenen, slik at for direkte segmental hepatisk levering. Vår tilnærming er å indusere ischemi i venstre side og median fliker i 60 minutter, under hvilken tid substansen som studeres er tilført. I dette tilfellet, pegylert-superoksiddismutase (PEG-SOD), en fri-radikal scavenger blir infusert direkte inn i det ischemiske segmentet. Denne serie av forsøk viser at infusjon av PEG-SOD er beskyttende mot hepatisk I / R-skade. Fordelene ved denne tilnærming med direkte injeksjon av molekylet inn i det ischemiske segment med en derav følgende senkning i distribusjonsvolum og reduksjon av systemiske bivirkninger.
Større hepatisk kirurgi med tilsig okklusjon, og levertransplantasjon, nødvendiggjøre en periode av varm ischemi, og en periode med reperfusjon som fører til iskemi / reperfusjon (I / R) skade 1. Konsekvensene av I / R-skade i leveren er blitt beskrevet i stor utstrekning 1, 2, 3. Konsekvenser av I / R-skade er beskrevet i litteraturen, omfatter: generering av reaktive oksygenforbindelser, initiering av den inflammatoriske kaskade inkludert aktivering av nøytrofile celler, Kupffer-celler og endotelceller, aktivering av hem oksygenase-systemet og aktivering av toll-lignende reseptorer, en ubalansen mellom endotelin og nitrogenoksid, aktivering av nukleær faktor-kB, og fremming av proinflammatorisk cytokin og adhesjonsmolekyl syntese 1, 2, 3. Disse pro-inflammatoriske hendelser kan lead til apoptose, nekrose, organdysfunksjon og eventuell organsvikt 3.
I / R-skade på organer bestemt for levertransplantasjon kan føre til tidlig tap av transplantat og bidrar til den aktuelle donor mangel som marginale organer er mer utsatt for skade 3. Det er for tiden 15,226 potensielle mottakere på venteliste for levertransplantasjon i USA 4 og bare 5950 levertransplantasjoner ble utført i 2015 fem. På grunn av denne ekstreme begrensning i organ tilgjengelighet, forskning utforsker lever I / R skade er nødvendig for å optimalisere organfunksjon og orgel utnyttelse.
Dyremodeller som brukes til å studere hepatisk I / R-skade er Rat hilar klem modeller og rottelever-transplantasjonsmodeller. Det finnes en rekke rotte hilar fastspenningsmodeller for tiden er i bruk. Den vanligste er en der portvenen, leverpulsåren og galle duct levere de venstre laterale og median fliker er fastspent ved hjelp av mikroklemmer 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 i 30 til 60 min 6, 7, 10, 13, 14, og deretter en periode av reperfusjon fra 60 min til 24 timer 7, 9, 10, 13, 14 er tillatt. I den venstre laterale og median fliker av rottelever omfatte omtrent 70% av leverparenkym 9. Noen protokoller som er utviklet for å studere ischemisk prekondisjonering omfatte periodisk klemming av hilar fartøyeneeller den bakbenet før en lengre periode med ischemi fremkalt ved sammenklemming av hilar fartøy 9, 13. Det finnes også flere modifikasjoner som er beskrevet i litteraturen. Den første er å klemme portvenen og leverarterien levere de venstre laterale og median fliker, men utelukker gallegangen 15. En annen modifikasjon er å indusere total hepatisk iskemi ved fastklemming av portvenen, rarterien og gallegang før deres inndeling 16, 17, 18, 19, 20. En tredje modifikasjon omfatter klemming av hilar fartøyer til høyre lapp i 30 til 60 min 8. En ytterligere modifikasjon omfatter klemming av vaskulære bunten i et bakben for å fremkalle skade på leveren 13, 21 </sup>. Forskjellige tilnærminger til hilar klemmen måten er illustrert i figur 1A-D.
Rottelever hilar klem modeller har blitt anvendt for å studere effekten av forskjellige molekyler og forbindelser på hepatisk I / R. Avhengig av den modell som brukes i disse molekylene er blitt levert ved hjelp av inhalering 11, epidural infusjon 12, intraperitoneal injeksjon 17, 18, 21, 22, intravenøs administrering 10, 14, 15, 19, 23, 24 eller injeksjon i den perifere mesenteriske vene 8 .
Modellen for rottelever hilar klemme beskrevet i denne rapporten inklues direkte kanylering av portalen tilførselen til iskemisk segmentet via en sidegren av portvenen (figur 2), som gjør det mulig for direkte segmental hepatisk levering av farmakologisk forbindelse som studeres. Vår tilnærming er å indusere ischemi i venstre side og median fliker i 60 minutter, under hvilket tidsrom en infusjon av substansen som undersøkes, i dette tilfellet, pegylert-superoksid dismutase, en fri-radikal scavenger 25 blir infusert direkte inn i det ischemiske segmentet . Blodprøver tas før induksjon av ischemi og ved 120 minutter etter reperfusjon. På dette punkt, blir dyrene avlivet og sampler tas fra de venstre og median fliker. I tillegg ble prøver tatt fra den høyre flik for å tjene som en intern kontroll.
Det er mange fordeler med denne tilnærmingen. Først og fremst, når den farmakologiske substansen som studeres kan injiseres direkte inn i det ischemiske segmentet volumet of fordeling er ganske lav sammenlignet med volumet av fordelingen av injeksjon inn i den systemiske sirkulasjon eller bukhulen. I tillegg gir denne fremgangsmåten reduserer, men ikke eliminerer, muligheten for systemiske bivirkninger.
Denne serien av eksperimenter vist at injeksjon av PEG-SOD til venstre og median fliker førte til signifikant reduksjon i frigivelsen av ALT, lipidperoksidasjon av cellemembraner (MDA), og vedlikehold av glutation (GSH) sammenlignet med kontroller (normal salt ). Levervev naser inkludert Alaninaminotransferase (ALT) er etablert markører for hepatocellulær skade. Nedgangen i ALT når den venstre lapp er injisert med PEG-SOD antyder en beskyttende virkning av PEG-SOD. Økt vev MDA indikerer forøket lipidperoxidasjon og regnes som en markør for oksidativt stress og skade vev. Overproduksjon av reaktive oksygenforbindelser fører til en økning i produksjonen av MDA 26. Den betydelige reduksjonen i vev MDA i dyrets venstre og median fliker når de ble injisert med PEG-SOD viser en beskyttende effekt av PEG-SOD. Dette er i samsvar med gjeldende forståelse at PEG-SOD beskytter celler mot skaderforårsaket av delvis reduserte reaktive oksygenforbindelser 27. I tillegg, i nærvær av reaktive oksygenforbindelser, glutation disulfid redusert til glutation (GSH) 28. Vedlikeholds i GSH i venstre og median fliker av leveren injisert med PEG-SOD styrker ytterligere den beskyttende effekten av PEG-SOD. I tillegg er det vist at det er økt spaltet for caspase-3, et produkt av apoptose, i vev eksponert for ischemi-reperfusjonsskade. Reduksjonen i spaltede caspase-3 i den venstre lapp når de ble behandlet med PEG-SOD tyder på at PEG-SOD fører til en reduksjon i apoptose.
Superoksyd-dismutase (SOD) er et kritisk enzym i detoxication av reaktive oksygenarter. Enzymet katalyserer omdannelsen av to superoksydanioner til hydrogenperoksid og vann. Enzymet katalase omdanner deretter hydrogenperoksyd til vann og oksygen, fullfører prosessen 25. Halveringstiden avnativt SOD begrenset dets anvendelse i eksperimentelle modeller inntil utviklingen av konjugerte polyetylenglykol-superoksiddismutase (PEG-SOD). Konjugering av SOD til polyetylenglykol øker dets halveringstid fra 6 minutter til 14 timer. Nguyen et al. vist evne til å dempe lipidperoksidasjon i hepatisk iskemi i en rottemodell, ved hjelp av systemisk tilførsel 29.
Det finnes en rekke mulige modifikasjoner av teknikken beskrevet her, og noen har tidligere blitt beskrevet i litteraturen. Avhengig av modellen benyttet molekyler har blitt levert ved hjelp av inhalering 11, epidural infusjon 12, intraperitoneal injeksjon 17, 18, 21, 22, intravenøs administrering 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 eller injeksjon i den perifere mesenteriske vene 8.
Det er flere viktige skritt i denne protokollen. Det viktigste er kanylering av portvenen. Hensyn må tas at hullet skjæres i venen ikke er for stor. Vevet er meget elastisk og hullet vil forstørre på egen hånd. Vi anbefaler å starte ved å skjære et hull som er 0,5 mm med mikrokirurgiske saks. Kanylen kan føres gjennom hullet ved hjelp av et instrument, noe som gir større fleksibilitet enn om forsøker å utføre denne delen av fremgangsmåten for hånd. I tillegg, mens innledningsvis å mate kanylen, det bør være rettet direkte mot den delinger av de venstre og høyre portalblodårene for å unngå å stikke et hull gjennom bakveggen av venen. Når kanylen tuppen når forgreningen, kan det da bli matet inn i den venstre vene spesifikkalliert. Når kanylen føres inn i den venstre portalvenen, som leverer både til venstre og median fliker, kan dens stilling bekreftes manuelt ved å føle det inne i venen. Dets posisjon kan også bli bekreftet ved å injisere en liten mengde kald saltoppløsning og ser blekende effekt på de medfølgende deler av leveren.
Leveren hilar klemmen modell i rotte gir en reproduserbar og stabil plattform for å demonstrere hepatisk iskemi-reperfusjonsskade. Variable hilar klem modeller har blitt benyttet av forskere for å studere den beskyttende effekt av anti-oksidanter og andre små molekyler 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Punkter variasjon inkluderer hvilke fartøy klemme ed, hvilket segment er gjort iskemisk, hvorvidt eller ikke gallegangen er inkludert, og lengden av perioden for reperfusjon 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. I tillegg, når denne modellen blir anvendt for å studere virkningen av administrering av et molekyl av administreringsmåten er også heterogene 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24. Det er flere fordeler med den beskrevne fremgangsmåte. For det første, direkte kanylering av portalen tilførselen til den iskemiske segmentet tillater direkte segmental hepatisk levering av den farmakologiske substansen som studeres. Dette tillater utnyttelse av de andre fliker av leveren som en intern kontroll. for det andre, tillater segment hepatisk kanylering til et redusert volum av distribusjon for molekylet som studeres. Denne tilnærmingen reduserer derved faren for systemiske bivirkninger som substansen injiseres direkte inn i leveren segmentet av interesse. direkte kanylering av den hepatiske segmentet gjør det mulig for stoffet som skal avgis pre-ischemi, Intra-ischemisk eller post-ischemi. Dette gjør det mulig for studium av molekyl effekten på et hvilket som helst punkt i den ischemi-reperfusjonsskade syklus. Med økt lengde av ischemisk tid og forhøyet nivå av skade ytterligere mulighet til å studere leveren regenerering ville være tilgjengelig.
Det er også noen begrensninger av denne tilnærmingen. Den første er oppstart kostnader. Kjøp av et kirurgisk mikroskop kan være en betydelig oppstart kostnader for en lab som ikke allerede har en. Denne teknikken kan være vanskelig eller umulig uten et mikroskop. Den andre er å lære kurve tid. Selv om denne prosedyren er relativt enkelt det krever litt trening, og det er sannsynlig at en nybegynner vil kreve et betydelig antall prosedyrer for å bli en ekspert.
I sammendrag, tillater denne modellen for en reproduserbar, enkelt og kostnadseffektivt plattform for å studere hepatisk iskemi-reperfusjonsskade. Selv om det i den protokoll som er beskrevet her polyetylen glycol-superoksid dismutase, en fri-radikal scavenger 25, ble infusert, kan denne modellen benyttes til infusjon av en rekke forskjellige farmakologiske stoffer for å evaluere deres effekt på I / R-skade i leveren.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Dennis Mathias for sitt illustrerende arbeid. Dette arbeidet ble støttet av NIH T32AI 106704-01A1 og T. Flesch Fund for organtransplantasjon, Perfusjons, ingeniørfag og Regeneration ved Ohio State University.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |