En unik råttlever hilar klämma modell utvecklades för att studera effekterna av farmakologiska molekyler vid lindring av ischemi-reperfusionsskada. Denna modell inkluderar direkt kanylering av portalen tillförseln till ischemisk leversegmentet via en gren av portalvenen, vilket möjliggör direkt leverleverans.
Större hepatisk kirurgi med inflödes ocklusion, och levertransplantation, nödvändiggör en period av varm ischemi, och en period av reperfusion leder till ischemi / reperfusion (I / R) skada med otaliga negativa konsekvenser. Potential l / R skada i marginella organ avsedda för levertransplantation bidrar till den nuvarande donatorbrist sekundärt till en minskad organutnyttjandegrad. En betydande behov föreligger att undersöka lever I / R skada i syfte att förmedla dess inverkan på transplantatfunktion vid transplantation. Råttlever hilar kläm modeller används för att undersöka effekterna av olika molekyler på hepatisk l / R skada. Beroende på modell, har dessa molekyler levererats med användning av inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injektion, intravenös administrering eller injektion in i den perifera mesenterica superior ven. En råttlever hilar klämmodell har utvecklats för att användas för att studera effekterna av farmakologiska molekyler i lindring I / R-skada. den described modell för råttlever hilar klämman inkluderar direkt kanylering av portalen tillförseln till ischemisk lever segmentet via en sidogren av portvenen, vilket möjliggör direkt segmentell leverleverans. Vår strategi är att framkalla ischemi i vänstra sido och median lober i 60 minuter, under vilken tid ämnet som studeras infunderas. I detta fall, pegylerat superoxiddismutas (PEG-SOD), en fri radikal-elimineringsmedel, infunderas direkt in i ischemisk segmentet. Denna serie experiment visar att infusion av PEG-SOD är skyddande mot hepatisk l / R skada. Fördelarna med detta tillvägagångssätt innefattar direkt injektion av molekylen till den ischemiska segment med åtföljande minskning av distributionsvolymen och minskning av systemiska biverkningar.
Större hepatisk kirurgi med inflödes ocklusion, och levertransplantation, nödvändiggör en period av varm ischemi, och en period av reperfusion leder till ischemi / reperfusion (I / R) skada 1. Konsekvenserna av l / R skada i levern har varit detaljerade utför 1, 2, 3. Konsekvenserna av I / R-skada i detalj i litteraturen innefattar: generering av reaktiva syretyper, initiering av den inflammatoriska kaskaden inklusive aktivering av neutrofiler, Kupffer-celler och endotelceller, aktivering av heme oxygenas systemet och aktivering av toll-liknande receptorer, en obalans mellan endotelin och kväveoxid, aktivering av nukleär faktor-kB, och främjande av proinflammatorisk cytokin och adhesionsmolekyl syntes 1, 2, 3. Dessa proinflammatoriska händelser kan lead till apoptos, nekros, organdysfunktion och slutligen organsvikt 3.
I / R-skada i organ avsedda för levertransplantation kan leda till tidig förlust transplantat och bidrar till den nuvarande donatorbrist som marginella organ är mer mottagliga för skada 3. Det finns för närvarande 15,226 potentiella mottagare på väntelista för levertransplantation i USA fyra och bara 5950 levertransplantationer utfördes 2015 5. På grund av denna extrema begränsning i tillgången på organ, forskning undersöker lever I / R skada behövs för att optimera transplantat funktion och organ utnyttjande.
Djurmodeller används för att studera lever l / R skada inkluderar rått hilar klämmodeller och råttlever transplantationsmodeller. Det finns en mängd olika råtta hilar klämmodeller för närvarande är i bruk. Det vanligaste är ett där portådern, leverartären och galla duct föra de vänstra laterala och median loberna kläms med hjälp av mikrokirurgiska klämmor 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 i 30 till 60 min 6, 7, 10, 13, 14, och sedan en period av reperfusion från 60 min till 24 h 7, 9, 10, 13, är 14 tillåtet. De vänstra laterala och median lober av råttlever innefattar ca 70% av den hepatiska parenkym 9. Vissa protokoll är utformade för att studera ischemisk prekonditionering inkluderar intermittent fastspänning av hilar kärleneller den bakre-lemmen före en längre period av ischemi inducerad genom fastklämning av hilar kärlen 9, 13. Det finns också flera modifieringar som beskrivs i litteraturen. Den första är att klämma portvenen och arteria hepatica föra de vänstra laterala och median lober, men exkluderar gallgången 15. En andra modifikation är att inducera total leverischemi genom att klämma portvenen, leverartären och gallgång före deras division 16, 17, 18, 19, 20. En tredje modifiering inkluderar klämning av de hilar fartyg till höger lob under 30 till 60 min 8. En ytterligare modifiering innebär att klämma den vaskulära bunt i en bakbenet för att framkalla skador i levern 13, 21 </sup>. Olika tillvägagångssätt för att den hilar klämförfarandet illustreras i Figur 1A-D.
Råttlever hilar kläm modeller har använts för att studera effekterna av olika molekyler och föreningar på hepatisk l / R. Beroende på den modell som användes dessa molekyler har levererats med hjälp av inhalering 11, epidural infusion 12, intraperitoneal injektion 17, 18, 21, 22, intravenös administrering 10, 14, 15, 19, 23, 24 eller injektion in i den perifera mesenterica superior ven 8 .
Modellen för råttlever hilar klämma beskrivs i denna rapport includes direkt kanylering av portalen tillförseln till den ischemiska segmentet via en sidogren av portvenen (Figur 2), som möjliggör direkt segmentell hepatisk tillförsel av den farmakologiska substansen som studeras. Vårt tillvägagångssätt är att inducera ischemi i de vänstra laterala och median lober för 60 min, under vilken tid en infusion av substansen som studeras, i detta fall, pegylerat superoxiddismutas, en fri radikal-elimineringsmedel 25, infunderas direkt in i ischemisk segmentet . Blodprover tas före induktion av ischemi och vid 120 min efter reperfusion. Vid denna punkt, är råttan offras och prover tas från vänster, och median lober. Dessutom tas prover från höger lob för att tjäna som en intern kontroll.
Det finns många fördelar med detta tillvägagångssätt. Först och främst, när den farmakologiska substansen som studeras kan direkt injiceras i ischemiska segment volym of fördelningen är ganska låg i jämförelse med volymen av fördelningen av injektion i den systemiska cirkulationen eller den peritoneala håligheten. Dessutom denna metod minskar, men inte eliminera, risken för systemiska biverkningar.
Denna serie av experiment visade att injektion av PEG-SOD i vänster och median lober ledde till signifikanta minskningar i frisättning av ALT, lipidperoxidation av cellmembran (MDA), och underhåll av glutation (GSH) i jämförelse med kontroller (normal saltlösning ). Levervävnadsnaser inklusive alaninaminotransferas (ALT) är etablerade markörer för hepatocellulär skada. Minskningen i ALT när den vänstra loben injiceras med PEG-SOD antyder en skyddande effekt av PEG-SOD. Ökad vävnad MDA indikerar ökad lipidperoxidation och anses vara en markör för oxidativ stress och vävnadsskada. Överproduktion av reaktiva syreradikaler orsakar en ökning i produktionen av MDA 26. Den betydande minskningen i vävnad MDA i djurets vänstra och median lober när de injiceras med PEG-SOD visar en skyddande effekt av PEG-SOD. Detta överensstämmer med den aktuella förståelsen att PEG-SOD skyddar cellerna från skadororsakas av partiellt reducerade reaktiva syrespecies 27. Dessutom, i närvaro av reaktiva syrespecies, är glutationdisulfid reduceras till glutation (GSH) 28. Upprätthållande i GSH i de vänstra och median lober i levern injicerades med PEG-SOD förstärker ytterligare den skyddande effekten av PEG-SOD. Dessutom det visas att det finns en ökad kluvna kaspas-3, en produkt av apoptos, i vävnad exponerad för ischemi-reperfusionsskada. Minskningen i kluvna kaspas-3 i den vänstra loben vid behandling med PEG-SOD antyder att PEG-SOD leder till en minskning i apoptos.
Superoxiddismutas (SOD) är en kritisk enzym i avgiftning av reaktiva syrespecies. Enzymet katalyserar omvandlingen av två superoxidanjoner till väteperoxid och vatten. Enzymet katalas omvandlar sedan väteperoxid till vatten och syre, slutför processen 25. Halveringstiden förnativt SOD begränsat dess användning i experimentella modeller fram till utvecklingen av konjugerad polyetylenglykol-superoxiddismutas (PEG-SOD). Konjugering av SOD till polyetylenglykol ökar dess halveringstid från 6 min till 14 h. Nguyen et al. visat sin förmåga att lindra lipidperoxidation i leverischemi i en råttmodell, med användning av systemisk avgivning 29.
Det finns en mängd potentiella modifieringar av tekniken beskrivs här och en del har tidigare beskrivits i litteraturen. Beroende på vilken modell som används molekylerna har levererats med hjälp av inhalering 11, epidural infusion 12, intraperitoneal injektion 17, 18, 21, 22, intravenös administrering 10, 14, 15 <sup>, 19, 23, 24 eller injektion in i den perifera mesenterica superior ven 8.
Det finns flera viktiga steg i detta protokoll. Det viktigaste är kanyle av portalen ven. Man måste vara försiktig att hålet skär i venen inte är för stor. Vävnaden är mycket elastisk och hålet kommer att förstora på egen hand. Vi rekommenderar att du börjar genom att skära ett hål som är 0,5 mm med mikro sax. Kanylen kan matas genom hålet med användning av ett instrument, som möjliggör större smidighet än om försöker utföra denna del av förfarandet för hand. Dessutom, medan en början matar kanylen, det bör riktas direkt mot förgreningen av den vänstra och högra portal vener för att undvika att peta ett hål genom den bakre väggen i venen. När kanylspetsen når bifurkationen, kan det sedan matas in i den vänstra ven specifikaalliera. Snart kanylen matas in i den vänstra portvenen, som levererar både vänster och median lober, kan dess position bekräftas manuellt genom att känna det inuti venen. Dess läge kan även bekräftas genom att injicera en liten mängd kall saltlösning och ser blanche effekt på den medföljande segmenten i levern.
Levern hilar klämma modell i råtta åstadkommer en reproducerbar och stabil plattform för att demonstrera hepatisk ischemisk-reperfusionsskada. Variabla hilar kläm modeller har använts av forskare för att studera de skyddande effekterna av anti-oxidanter och andra små molekyler 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Platser av variation inkluderar vilka fartyg är klämman ed, vilket segment är gjorda ischemisk, huruvida eller inte gallgången ingår och längden av perioden för reperfusion 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Dessutom, är också när denna modell används för att studera effekterna av administrering av en molekyl administreringsväg heterogena 8, 10, 11,"> 12, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, Det finns flera fördelar med att den beskrivna metoden. Först direkt kanylering av portalen tillförseln till den ischemiska segmentet möjliggör direkt segmentell hepatisk tillförsel av 24. den farmakologiska substansen som studeras. Detta möjliggör utnyttjande av de andra loberna i levern som en inre kontroll. för det andra, möjliggör segmentell leverkanylering för en reducerad volym av distribution i molekylen som studeras. Detta tillvägagångssätt minskar därigenom risken för systemiska biverkningar som ämnet injiceras direkt i levern segment av intresse. direkt kanyle av lever segment möjliggör för ämnet som ska levereras före ischemi, Intra-ischemi eller efter ischemi. Detta gör det möjligt för studier av molekylens effekt vid någon punkt i ischemi-reperfusionsskada cykel. Med ökad längd av ischemisk tid och ökad nivå av skada ytterligare en möjlighet att studera leverregenerering skulle vara tillgängliga.
Det finns också vissa begränsningar med denna metod. Den första är startkostnad. Köpet av ett kirurgiskt mikroskop kan vara en betydande uppstartskostnader för ett labb som inte redan har ett. Denna teknik kan vara svårt eller omöjligt utan ett mikroskop. Den andra är att lära kurva tid. Även om detta förfarande är relativt enkelt det kräver lite övning och det är troligt att en nybörjare kommer att kräva ett stort antal förfaranden för att bli en expert.
Sammanfattningsvis möjliggör en reproducerbar, enkel och kostnadseffektiv plattform för att studera lever ischemi-reperfusionsskada denna modell. Även om i det protokoll som beskrivs här polyeten glycol-superoxiddismutas, en fri radikal-elimineringsmedel 25, infuserades, kunde denna modell användas för att infundera ett flertal olika farmakologiska ämnen för att utvärdera deras effekter på l / R skada i levern.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för Dennis Mathias för hans belysande arbete. Detta arbete stöddes av NIH T32AI 106704-01A1 och T. Flesch fonden för organtransplantation, Perfusion, Engineering and Regeneration vid Ohio State University.
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 200- 250 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane Molecular Weight 184.5 | Piramal Healthcare | ||
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
27-0 Micro-Cannula | Braintree Scientific | MC-28 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
Polyethylene Glycol – Superoxide Dismutase (PEG-SOD) | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
GenieTouch | Kent Scientific | ||
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Microsurgical Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Other Instruments | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small Mosquito Clamps | Generic | ||
Analysis | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alannine aminotransferase (ALT) assay | Biovision | K752-100 | |
Malondialdehye (MDA) assay | Abcam | ab118970 | |
Glutathione (GSH) assay | Cayman Chemical | 7030002 | |
Antibodies – Cleaved Caspase-3 and Actin | Cell Signaling Tecnology | Antibody 9661 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
RIPA Lysis and Extraction Buffer | Millipore | 10-188 |