The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
粘菌是独居生活的土壤变形虫,关于细菌和其他微生物,这是由吞噬占用饲料。它具有独特和卓越的生命周期,因为它的发现1已成为研究的主要领域。在多细胞发展2和趋3的分子基础早期兴趣很快被研究集中于细胞运动性,细胞极性,先天免疫补充。此外,D。菌是作为生物医学研究4,5模型系统。
最近,我们成立D.菌作为一个新的系统来研究蛋白质的质量控制(PQC)系统6,7。其蛋白质在聚集倾向朊状蛋白质,这对以蛋白质量控制8个挑战富集。调查是否D.菌开发了特殊的分子机制,以控制其高度股份公司gregation容易发生蛋白质组,我们研究了两个在正常生长条件和应力期间聚集倾向标记蛋白的行为。应力的条件下,如热应力,可用于增加蛋白质错误折叠9的速率。因此,我们寻求的系统,其中,我们能诱导的温度变化,同时按照标记蛋白的行为。为了这个目的,我们结合使用热阶段插入件(冷却室)珀耳帖控制的加热活细胞成像。该方法使我们能够保持恒定和均匀的温度,以及以诱导快速而精确的温度变化。
活细胞成像是用于研究各种D中的生物过程的菌 。然而,这种方法面临两个主要限制。首先,将细胞显示高运动性和倾向于迁移出的视场,从而跟踪单个细胞通常需要大面积成像。细胞迁移率可以通过琼脂覆盖10被降低,然而,在这些条件不适合长期成像由于存活率下降。其次,D.菌细胞显示到光毒性,这导致细胞变圆和有丝分裂停滞11特别高的灵敏度。以前的协议通过加入抗坏血酸作为自由基清除剂和减少曝光时间12解决了这个问题。如果感兴趣的蛋白以低水平表达,并显示弱荧光信号,后者可以是至关重要的。作者还建议要么通过在空调房间成像或通过使用温度控制孵化箱,覆盖的目标和显微镜载物台12,以提供21℃的恒定温度。
这里,我们通过使用冷却室设置在23℃下描述了具有改进的温度控制的方法。在成像过程中我们设置了显著增强了光毒性的阻力。它允许更高的曝光时间和更高的激励光强度的用法。这是特别重要的时间推移成像过程中,当时间间隔需要针对成像位置的数量和所使用的曝光时间仔细地平衡。增加成像位置的数量的可能性还允许更宽成像区域的覆盖范围,并促进个体细胞的跟踪在一段较长的时间。
这里所描述的协议可以用来研究响应于热诱导应力感兴趣的特定蛋白质的行为。温度上升至30℃已报道触发热应激反应和D的在这些条件下的生存能力菌被显着地降低了。
修改
该协议可以被修改,以比较同胁迫条件下不同的蛋白质的行为。为此,表达相同荧光标记不同的蛋白质细胞转移到多井菜肴,如四腔菜(第1.3.1节)。该协议也可以在细胞共表达不同的标记物,如GFP或RFP蛋白施加。这可以是例如用于监测蛋白质的质量控制(PQC)系统的不同组件的行为。表达GFP标记聚集的标记和不同的RFP标记PCQ组件细胞可以使用多井观察抛出成像。这确保相同的应力条件下(温度上升/下降,温度上升/下降的持续时间速度),并允许进行比较研究。
此外,该协议可以用于研究PQC系统对热应激反应的影响。各组分的活性可以通过改变使用的遗传工具,例如敲除或过度表达水平或通过使用商购的特异性抑制剂6进行调制。蛋白酶可以通过添加MG132(100μM)或乳胞素(10μM)的生长培养基中被抑制。伴侣Hsp90的可使用格尔德霉素(6微米)或根赤壳菌素(10μM)被抑制。伴侣热休克蛋白70可与VER-155088抑制,虽然我们无法证实抑制的功效在我们的实验设置为止。抑制剂应成像之前添加一天,将细胞温育14小时。
Criti该议定书内校准步骤
为热诱导扰动的评估关键步骤是先于成像实验的细胞的状态。在酵母中的研究表明,细胞在固定相13获得的各种环境胁迫的抵抗。我们还观察到最小响应施加热应激,如果D.菌细胞已经成像之前达到稳定期。因此,保持恒定的细胞数<5×10 5个细胞/ ml是至关重要的。
此外,高细胞数量可以从D的生长周期诱导转型菌的发育周期,从而引发饥饿的途径,这可能会导致不同的响应热应激。如果高细胞数在热应力,流后的恢复阶段达到和凝集细胞可以与数据分析干扰随着细胞移出焦点( 见图4)。
内容“>的技术限制相对于现有方法的技术意义
在与现有的设置,如使用的空调房,温度控制的培育箱覆盖的目标和显微镜载物台或温度控制的阶段和客观衣领比较,使用冷却室提供了环境的一个更精确的控制温度。在冷却室中的珀耳帖元件可以保持恒定和均匀的统023在整个实验装置。在古典设置中,局部温度差异可能导致不同的观察结果。此外,它可以迅速和快速响应的温度引起的变化,而经典的设置适应非常缓慢地引起的温度变化,特别是降低温度。在冷却室中的珀耳帖元件也可以覆盖一个更宽的温度范围(15-40℃)比传统的设置,与到达温度如15℃或40℃下是很困难的。
粘菌是光毒性特别敏感。以前的研究使用抗坏血酸作为清除剂,以减少光毒性。然而,长期的成像时间需要额外补充。此外,使用抗坏血酸限于其中感兴趣的机构不受抗氧化剂补充研究。我们建议,温度控制的成像可被用来作为一种替代APPRoach以最小化光毒性和可与加成抗坏血酸被组合以进一步减少毒性。
光毒性效果可以通过使用冷却室中提供的23℃的恒定和均匀的温度最小化。使用温度控制的成像细胞显示较少的光毒性,如细胞变圆的迹象,在较长的时间段。这也使得成像具有更高的强度,更小的时间间隔或视(视场)更多的领域。
一般应用
在更高温度下的热应力已经显示出触发不同热应激反应14。因此,温度上升到34℃或37℃可能诱导不同的响应。除了所应用的温度应力,一个特定的压力的情况下的持续时间可以被修改以研究立即响应或长期适应热应力。
在一般情况下,所描述的协议可以是扩大到一系列广泛的应用。由于精确的温度控制大大降低光毒性作用,该协议可以在需要高的曝光时间和/或较高的激发光强度, 例如 ,对于具有低表达水平可视化蛋白设置来使用,或者在短的时间间隔组合成像, 例如 ,延时成像期间之间。它也可以是用于成像跨越整个细胞的对象是有利的, 例如 ,微管,因为这些设置需要大量的光学Z截面的。
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |