The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Dictyostelium discoideum er ensomme jord levende amøber, der lever af bakterier og andre mikroorganismer, som tages op af fagocytose. Det har en unik og bemærkelsesværdig livscyklus, der har været et stort forskningsområde siden sin opdagelse 1. Den tidlige interesse i multicellulære udvikling 2 og den molekylære basis for kemotaksi 3 blev snart suppleret af undersøgelser, der fokuserer på cellemotilitet, cellepolaritet, medfødte immunitet. Desuden D. discoideum blev indført som et modelsystem til biomedicinsk forskning 4,5.
For nylig etablerede vi D. discoideum som et nyt system til at studere protein kvalitetskontrol (PQC) systemet 6,7. Dens proteomanalyse er beriget i sammenlægning-tilbøjelige prion-lignende proteiner, som udgør en udfordring til protein kvalitetskontrol 8. For at undersøge om D. discoideum har udviklet særlige molekylære mekanismer til at styre sit meget agmenighed-tilbøjelige proteom, vi studerede adfærd sammenlægning-tilbøjelige markørproteiner både under normale vækstbetingelser og under stress. Stressbetingelser såsom varmestress, kan anvendes til at øge hastigheden af protein misfoldning 9. Derfor søgte vi et system, hvor vi kunne fremkalde temperaturændringer og samtidig følge adfærd markørproteiner. Til dette formål har vi kombinerede live-cell imaging med Peltier-kontrolleret opvarmning ved anvendelse af et termisk trin indsats (kølekammer). Denne metode tillod os at opretholde en konstant og ensartet temperatur samt til at inducere en hurtig, men alligevel præcis temperaturændring.
Live-cell imaging benyttes til at undersøge en række biologiske processer i D. discoideum. Men denne tilgang står over for to store begrænsninger. Først cellerne udviser høj motilitet og har tendens til at migrere ud af synsfeltet, således sporing af individuelle celler kræver ofte billeddannelse af et stort område. Cellen mobilitet kannedsættes med Agar overlay 10, men disse betingelser er ikke egnede til langvarig billeddannelse på grund af et fald i levedygtighed. Sekund, D. discoideum-celler udviser en særlig høj følsomhed for foto-toksicitet, hvilket resulterer i celleafrunding og mitosestandsning 11. Tidligere protokoller behandlet dette spørgsmål ved tilsætning af ascorbat som radikaler og reduktion af eksponering gange 12. Sidstnævnte kan være kritisk, hvis proteinet af interesse udtrykkes ved lave niveauer og viser en svag fluorescens-signal. Forfatterne foreslår også at give en konstant temperatur på 21 ° C, enten ved billedbehandling i et airconditioneret rum eller ved at bruge temperaturstyrede inkubation kasser, som dækker det objektive og mikroskopbordet 12.
Her beskriver vi en fremgangsmåde med forbedret temperaturkontrol ved hjælp af en kølekammer indstillet ved 23 ° C. Under billeddannelse vores set-up forøger markant modstand til foto-toksicitet. Dettillader brugen af højere eksponeringstider og højere excitations- lysintensiteter. Dette er særlig vigtigt i løbet af time-lapse billeddannelse, da tidsintervallerne skal være nøje afbalanceret forhold til antallet af positioner afbildet og behandlingstid brugt. Muligheden for at øge antallet af afbildede positioner tillader også dækning af et bredere billedområde og letter sporing af individuelle celler over en længere periode.
Protokollen beskrevet her kan anvendes til at undersøge opførslen af et bestemt protein af interesse i afhængighed af varmeinduceret stress. Temperaturstigning til 30 ° C er blevet rapporteret til at udløse varmestress respons og under disse betingelser levedygtighed D. discoideum er markant reduceret.
Ændringer
Protokollen kan ændres for at sammenligne adfærden af forskellige proteiner under de samme belastningsbetingelser. Til dette, er celler, der udtrykker forskellige proteiner med den samme fluorescerende fragment overført til multi-brønde, såsom fire kammer retter (afsnit 1.3.1). Protokollen kan også anvendes på celler co-ekspression af proteiner med forskellige markører, såsom GFP eller RFP. Dette kan for eksempel anvendes til at overvåge adfærden af forskellige komponenter af proteinet kvalitetskontrol (PQC) system. Celler, der udtrykker GFP-mærket aggregering markør og forskellige RFP-mærkede PCQ komponenter kan observeres ved anvendelse af multi-brønddished til billeddannelse. Dette sikrer de samme stress betingelser (hastighed temperaturstigning / fald, varigheden af temperaturstigningen / fald) og giver mulighed for komparative studier.
Endvidere kan protokollen anvendes til at undersøge indflydelsen af PQC system på varmestress respons. Aktiviteten af komponenterne kan moduleres ved at ændre ekspressionsniveauer anvende genetiske værktøjer såsom knock-out eller overekspression eller ved anvendelse af kommercielt tilgængelige specifikke inhibitorer 6. Proteasomet kan inhiberes ved tilsætning MG132 (100 uM) eller lactacystin (10 uM) til vækstmediet. Chaperonen Hsp90 kan inhiberes ved anvendelse af geldanamycin (6 uM) eller radicicol (10 uM). Den chaperone Hsp70 kan hæmmes med VER-155.088, selvom vi ikke kunne bekræfte effekten af hæmning i vores eksperimentelle indstillinger hidtil. Inhibitorer bør tilføjes en dag før billeddannelse og cellerne inkuberes i 14 timer.
Criti cal Steps i protokollen
Det kritiske trin for vurderingen af varme-induceret perturbation er den tilstand af cellerne forud for imaging eksperiment. Studier i gær viste, at cellerne udvikler resistens over for en række miljømæssige påvirkninger under stationær fase 13. Vi observerede også minimal lydhørhed over for anvendt varmestress hvis D. discoideum celler havde nået stationær fase før billeddannelse. Derfor opretholde et konstant celle nummer <5 x 10 5 celler / ml er kritisk.
Endvidere kan høje celletal inducerer overgangen fra den vegetative cyklus af D. discoideum til den udviklingsmæssige cyklus, hvilket udløser sult veje, der kan føre til et andet svar på varmestress. Hvis høje celleantal nås i opsvingsfasen efter varmestress, streaming og aggregere celler kan forstyrre dataanalyse som cellerne flytte ud af fokus (se figur 4).
indhold "> Begrænsning af Teknik Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende metoder
I sammenligning med eksisterende opsætninger såsom brugen af aircondition, temperaturstyrede inkubation kasser omfattende mål og etaperne mikroskop scenen eller temperaturstyrede og objektive kraver, brugen af en kølende kammer giver en mere præcis styring af den omgivende temperatur. Peltier-element i kølekammeret kan opretholde en konstant og ensartet temperatur hele forsøgsopstillingen. I klassiske opsætninger, kan lokale temperaturforskelle føre til forskellige observation resultater. Desuden kan det reagere hurtigt og hurtigt på inducerede ændringer i temperaturen, mens klassiske opsætninger tilpasse meget langsomt til inducerede temperaturændringer, især sænkning af temperaturen. Peltier-element i kølekammeret kan også dække et bredere temperaturområde (15-40 ° C) end klassiske opsætninger, som nåede temperaturer, såsom 15 ° C eller 40 ° C er meget vanskelig.
Dictyostelium discoideum er særligt følsomme over for foto-toksicitet. Tidligere undersøgelser anvendte ascorbat som scavenger til at reducere foto-toksicitet. Men lange billeddiagnostiske perioder kræver ekstra tilskud. Endvidere er anvendelsen af ascorbat begrænset til undersøgelser, hvor mekanismen af interesse ikke er berørt af antioxidant supplement. Vi foreslår, at temperaturstyret billeddannelse kan anvendes som en alternativ ca.oach at minimere foto-toksicitet og kan kombineres med tilsætning af ascorbat til yderligere at reducere toksicitet.
Fototoksisk effekt kan minimeres ved at tilvejebringe en konstant og ensartet temperatur på 23 ° C under anvendelse af et kølekammer. Celler filmede med temperaturstyring viser færre tegn på foto-toksicitet, sådan celle afrunding, for en længere periode. Dette giver også billeddannelse med højere intensiteter, mindre tidsintervaller eller flere synsfelter (FOVs).
Generel anvendelse
Varmestress ved højere temperaturer har vist sig at udløse en anden varme stressrespons 14. Derfor forøgelse af temperaturen til 34 ° C eller 37 ° C kan fremkalde en anden reaktion. Ud over den anvendte temperatur stress, kan varigheden af en bestemt stresstilstand modificeres til at studere den umiddelbare reaktion eller langsigtet tilpasning varmestress.
Generelt kan den beskrevne protokol væreudvidet til en bred vifte af anvendelser. Fordi præcis temperaturstyring reducerer tilgængeligt-toksiske virkninger, kan protokollen anvendes i indstillinger, som kræver høje eksponeringstider og / eller højere excitations- lysintensiteter, fx til visualisering proteiner med et lavt ekspressionsniveau, eller i kombination med korte tidsintervaller mellem billedbehandling, fx under tidsforskudt billeddannelse. Det kan også være fordelagtigt til billeddannelse genstande, der spænder over hele cellen, fx mikrotubuli, da disse indstillinger kræver et højt antal optiske z-sektioner.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |