The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Dictyostelium discoideum sont solitaires amibes vivant du sol qui se nourrissent de bactéries et d' autres micro – organismes, qui sont prises par phagocytose. Il a un cycle de vie unique et remarquable qui a été un domaine de recherche important depuis sa découverte 1. L'intérêt précoce pour le développement multicellulaire 2 et la base moléculaire de la chimiotaxie 3 a été rapidement complétée par des études portant sur la motilité cellulaire, la polarité cellulaire, l' immunité innée. En outre, D. discoideum a été introduit en tant que système modèle pour la recherche biomédicale 4,5.
Récemment, nous avons établi D. discoideum comme un nouveau système pour étudier le contrôle de la qualité des protéines (PQC) 6,7 système. Son protéome est enrichi en protéines prion-like d'agrégation sujettes, ce qui pose un défi à la protéine de contrôle de la qualité 8. Afin de déterminer si D. discoideum a développé des mécanismes moléculaires spécifiques pour contrôler sa très aggrégation sujettes protéome, nous avons étudié le comportement des marqueurs de protéines d'agrégation sujettes à la fois dans des conditions de croissance normales et pendant le stress. Les conditions de stress, tels que le stress thermique, peuvent être utilisés pour augmenter le taux de protéines repliement 9. Par conséquent, nous avons cherché un système où l'on pouvait induire des changements de température et simultanément suivre le comportement des protéines marqueurs. A cet effet, nous avons combiné l'imagerie des cellules vivantes avec chauffage Peltier contrôlé en utilisant une (chambre de refroidissement) insert de scène thermique. Cette méthode nous a permis de maintenir une température constante et uniforme, ainsi que pour induire un changement rapide de la température, mais précis.
Imagerie des cellules vivantes est utilisé pour étudier une variété de processus biologiques dans D. discoideum. Cependant, cette approche se heurte à deux limites majeures. Tout d'abord, les cellules présentent une grande mobilité et ont tendance à migrer hors du champ de vision, donc le suivi de cellules individuelles nécessite souvent l'imagerie d'une grande surface. La mobilité cellulaire peutêtre réduite par Agar overlay 10, cependant, ces conditions ne conviennent pas pour imagerie longue durée en raison d'une baisse de la viabilité. En second lieu , D. cellules discoideum montrent une sensibilité particulièrement élevée à la photo-toxicité, qui se traduit par l' arrondissement des cellules et arrêt de la mitose 11. Protocoles précédents ont abordé cette question par addition d'ascorbate comme fixateur et la réduction des temps d' exposition 12 radical. Ce dernier peut être critique si la protéine d'intérêt est exprimée à des niveaux bas et montre un signal de fluorescence faible. Les auteurs suggèrent également de fournir une température constante de 21 ° C , soit par imagerie dans une salle climatisée ou en utilisant des boîtes d'incubation à température contrôlée, qui couvrent l'objectif et microscope étape 12.
Ici, nous décrivons une méthode avec un meilleur contrôle de la température à l'aide d'une chambre de refroidissement fixé à 23 ° C. Au cours de l'imagerie notre set-up améliore considérablement la résistance à la photo-toxicité. Ilpermet l'utilisation de l'augmentation des temps d'exposition et intensités lumineuses plus élevées d'excitation. Ceci est d'une importance particulière lors de l'imagerie time-lapse, les intervalles de temps doivent être soigneusement équilibrée par rapport au nombre de positions imagées et le temps d'exposition utilisé. La possibilité d'augmenter le nombre de postes imagées permet également la couverture d'une zone de formation d'image plus large et facilite le suivi de cellules individuelles pendant une période de temps plus longue.
Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le comportement d'une protéine particulière d'intérêt en réponse au stress induit par la chaleur. Augmentation de la température à 30 ° C a été rapporté pour déclencher la réponse au stress de la chaleur et dans ces conditions , la viabilité de D. discoideum est nettement réduite.
Modifications
Le protocole peut être modifié pour comparer le comportement des différentes protéines dans les mêmes conditions de stress. Pour cela, les cellules exprimant des protéines différentes avec le même marqueur fluorescent sont transférés dans des boîtes multi-puits, tels que quatre plats de chambre (section 1.3.1). Le protocole peut également être appliquée sur les cellules des protéines avec des marqueurs différents, tels que la GFP ou RFP co-exprimant. Cela peut être par exemple utilisé pour surveiller le comportement des différents composants du système de contrôle de la qualité des protéines (PQC). Les cellules exprimant GFP-tagged agrégation marqueur et différents composants PCQ DP marqués peuvent être observés à l'aide multi-puitsprodiguées pour l'imagerie. Cela garantit les mêmes conditions de stress (vitesse de montée en température / diminution, la durée de la température augmentation / diminution) et permet des études comparatives.
En outre, le protocole peut être utilisé pour étudier l'influence du système PQC sur la réponse au stress thermique. L'activité des composants peut être modulée en modifiant les niveaux d'expression en utilisant des outils génétiques tels que knock-out ou à la surexpression ou en utilisant des inhibiteurs spécifiques disponibles dans le commerce 6. Le protéasome peut être inhibée par l'addition MG132 (100 uM) ou de lactacystine (10 uM) dans le milieu de croissance. Le chaperon Hsp90 peut être inhibée en utilisant geldanamycine (6 uM) ou radicicol (10 uM). Le chaperon Hsp70 peut être inhibée avec VER-155088, bien que nous ne pouvions pas confirmer l'efficacité de l'inhibition dans nos paramètres expérimentaux jusqu'à présent. Les inhibiteurs devraient être ajoutés un jour avant l'imagerie et les cellules sont incubées pendant 14 heures.
Criti cal étapes dans le protocole
L'étape critique pour l'évaluation de la perturbation induite par la chaleur est l'état des cellules avant l'expérience d'imagerie. Des études ont montré que la levure cellules acquièrent une résistance à divers stress environnementaux durant la phase stationnaire 13. Nous avons également observé la réactivité minimale à appliquer le stress thermique si D. cellules discoideum avaient atteint la phase stationnaire avant l' imagerie. Par conséquent, le maintien d' un numéro de cellule constante de <5 x 10 5 cellules / ml est critique.
En outre, un nombre élevé de cellules peuvent induire la transition du cycle végétatif de D. discoideum le cycle de développement, déclenchant ainsi des voies de famine, ce qui pourrait conduire à une réponse différente au stress thermique. Si un grand nombre de cellules sont atteintes dans la phase de récupération après un stress thermique, le streaming et les cellules d' agrégation peuvent interférer avec l' analyse des données que les cellules se déplacent hors du foyer (voir la figure 4).
content "> Limitation de la Technique Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes
En comparaison avec les configurations existantes, telles que l'utilisation des chambres climatisées, des boîtes d'incubation à température contrôlée couvrant les objectifs et les étapes de la phase de microscope ou à température contrôlée et des colliers objectifs, l'utilisation d'une chambre de refroidissement fournit un contrôle plus précis de la température ambiante température. Le Peltier-élément dans la chambre de refroidissement peut maintenir un système constant et uniformetempérature tout au long du montage expérimental. Dans les configurations classiques, les différences locales de température peuvent conduire à des résultats différents d'observation. En outre, il peut réagir rapidement et rapidement aux changements induits dans la température, tandis que des configurations classiques d'adapter très lentement aux changements de température induits, en particulier l'abaissement de la température. Le Peltier-élément dans la chambre de refroidissement peut également couvrir une gamme plus large de température (15-40 ° C) que les configurations classiques, avec lesquelles des températures atteignant telles que 15 ° C ou 40 ° C est très difficile.
Dictyostelium discoideum est particulièrement sensible à la photo-toxicité. Des études antérieures utilisées ascorbate comme fixateur pour réduire la photo-toxicité. Toutefois, les périodes d'imagerie longues nécessitent un supplément additionnel. De plus, l'utilisation d'ascorbate est limitée aux études où le mécanisme d'intérêt ne sont pas affectés par le supplément d'antioxydants. Nous proposons que l'imagerie à température contrôlée peut être utilisé comme une solution de rechange approche pour minimiser la photo-toxicité et peut être combiné avec l'addition d'ascorbate de diminuer encore la toxicité.
effets phototoxiques peuvent être réduits au minimum en prévoyant une température constante et uniforme de 23 ° C en utilisant une chambre de refroidissement. Les cellules imagées en utilisant le contrôle de la température montrent moins de signes de photo-toxicité, tels l'arrondissement des cellules, pour une période de temps plus longue. Cela permet également l'imagerie avec des intensités plus élevées, des intervalles de temps plus petits ou plus champs de vision (FOV).
Application générale
Le stress thermique à des températures plus élevées a été montré pour déclencher une réaction de stress de chaleur différente 14. Par conséquent, l'augmentation de la température à 34 ° C ou 37 ° C, peut induire une réponse différente. En plus de la contrainte de la température appliquée, la durée d'une situation de stress particulière peut être modifié de manière à étudier la réponse immédiate ou à l'adaptation à long terme du stress thermique.
En général, le protocole décrit peut êtreétendu à un large éventail d'applications. Parce que le contrôle précis de la température permet de réduire considérablement les effets photo-toxiques, le protocole peut être utilisé dans des environnements qui nécessitent des temps d'exposition élevés et / ou des intensités de lumière d'excitation, par exemple pour visualiser les protéines avec un faible niveau d'expression, ou en combinaison avec des intervalles de temps courts entre l' imagerie, par exemple, lors de l' imagerie time-lapse. Il peut également être avantageux pour l' imagerie d' objets couvrant toute la cellule, par exemple, les microtubules, étant donné que ces paramètres nécessitent un grand nombre de profilés en Z optiques.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |