The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
細胞性粘菌食作用によって取り込まれる細菌や他の微生物を餌孤独な土壌生活アメーバ、です。それは、その発見以来、1研究の主要な分野となっているユニークで顕著なライフサイクルを有します。多細胞の開発2および走化性3の分子基盤の初期の関心はすぐに細胞運動、細胞極性、先天性免疫に焦点を当てた研究によって補完されました。また、D. discoideumのは、生物医学研究の4,5のためのモデルシステムとして導入されました。
最近、我々はDを設立しましたdiscoideumのタンパク質品質管理(PQC)システム6,7を研究するための新たなシステムとして。そのプロテオームは、タンパク質品質管理8への課題となって凝集しやすいプリオン様タンパク質、に富んでいます。 D.かどうかを調べるために、 discoideumのは、その高度AGを制御するために、特別な分子機構を開発しましたgregationが発生しやすいプロテオーム、我々は通常の成長条件の下で、ストレス時の両方で凝集しやすいマーカータンパク質の挙動を研究しました。このような熱応力等の応力条件は、タンパク質ミスフォールディング9の速度を増加させるために使用することができます。したがって、我々は、温度変化を誘導し、同時にマーカータンパク質の挙動をたどることができ、システムを探していました。この目的のために、我々は、熱ステージインサート(冷却室)を用いてペルチェ制御加熱生細胞イメージングを組み合わせました。この方法では、我々は、一定で均一な温度を維持するだけでなく、迅速な、まだ正確な温度変化を誘発させました。
生細胞イメージングはDの生物学的プロセスの多様な研究するために使用されますdiscoideumの 。しかしながら、このアプローチは、2つの主要な制約に直面しています。最初に、細胞は、このように個々の細胞の追跡は、多くの場合、大面積の画像化を必要とする、高い運動性を表示し、視野の外に移動する傾向があります。セルの移動することができます寒天オーバーレイ10によって減少させることが、しかしながら、これらの条件は、生存率の減少に起因する長期的イメージングのために適していません。第二に、D. discoideumの細胞は、細胞の丸めと有糸分裂停止11その結果フォト毒性、特に高い感度を示します。前のプロトコルは、ラジカルスカベンジャーと露光時間12の減少としてアスコルビン酸を添加することによって、この問題を取り上げました。関心対象のタンパク質を低レベルで発現され、弱い蛍光信号を示している場合、後者は重要であることができます。著者らはまた、エアコン付きの部屋で撮影したり、客観的かつ顕微鏡ステージ12をカバーする温度制御インキュベーションボックスを使用してのいずれか21℃の一定温度を提供することを示唆しています。
ここでは、23℃に設定した冷却チャンバを使用することにより改善された温度制御を備えた方法を記載しています。大幅に私たちのセットアップを撮像中に光毒性に対する耐性を向上させます。それより高い露光時間およびより高い励起光強度の使用を可能にします。時間間隔は、撮像された位置の数および使用される露光時間に対して慎重にバランスをとる必要があり、これは、タイムラプス撮影中に特に重要です。画像形成された位置の数を増加させる可能性も広い撮像領域のカバレッジを可能にし、より長い期間にわたって個々の細胞の追跡を容易にします。
ここで説明するプロトコルは、熱誘発ストレスに応答して、目的の特定のタンパク質の挙動を研究するために使用することができます。 30°DのCは、熱ストレス応答を誘発することが報告されており、これらの条件下で生存能力の温度上昇discoideumのが著しく低減されます。
修正
プロトコルは、同じストレス条件下で異なるタンパク質の挙動を比較するために修飾することができます。このため、同一の蛍光タグを有する異なるタンパク質を発現する細胞は、四室皿(セクション1.3.1)のように、マルチウェルディッシュに移します。プロトコルはまた、GFPまたはRFPなどの異なるマーカーを有するタンパク質を同時発現する細胞に適用することができます。これは、タンパク質の品質管理(PQC)システムのさまざまなコンポーネントの動作を監視するために使用される例であることができます。 GFPタグ付き凝集マーカーおよび異なるRFPタグPCQ成分を発現する細胞は、マルチウエルを用いて観察することができイメージングのために皿。これは、同じストレス条件(温度上昇/低下の速度、温度上昇/低下の持続時間)を保証し、比較研究が可能になります。
また、プロトコルは、熱ストレス応答のPQCシステムの影響を研究するために使用することができます。成分の活性は、ノックアウトまたは過剰発現などの遺伝子ツールを使用して、発現レベルを変化させることによって、または市販の特異的阻害剤6を使用することによって調節することができます。プロテアソームは、増殖培地にMG132(100μM)またはラクタシスチン(10μM)を添加することにより抑制することができます。シャペロンHsp90は、ゲルダナマイシン(6μM)またはラディシコール(10μM)を用いて阻害することができます。我々はこれまでの我々の実験設定で、阻害の有効性を確認することができませんでしたが、シャペロンHsp70が、VER-155088に抑制することができます。阻害剤は、イメージングの前に一日を追加する必要があり、細胞を14時間インキュベートします。
Critiプロトコル内のCALのステップ
熱による摂動を評価するための重要なステップは、イメージング実験に先立って、細胞の状態です。酵母での研究は、細胞が定常期13の間に環境ストレスの様々な耐性を獲得することを示しました。 D.あれば我々はまた、かかる熱応力を最小限の応答性を観察しましたdiscoideumの細胞は、イメージング前に定常期に達しました。したがって、一定の細胞数<5×10 5細胞/ mlを維持することが重要です。
また、高い細胞数はDの栄養サイクルからの移行を誘導することができますこのようにストレスを加熱するために異なる応答につながるかもしれない飢餓経路を、トリガ、発達サイクルにdiscoideumの 。高い細胞数は、熱ストレス、ストリーミング後の回復期に到達すると、細胞が焦点から外れるように凝集細胞は、データ分析を妨害し得る場合( 図4参照)。
コンテンツ ">テクニックの制限既存の方法に関して技術の意義
このような目標や顕微鏡ステージや温度制御ステージと客観襟をカバーするエアコン付きの客室、温度制御インキュベーションボックスの使用など、既存のセットアップと比較して、冷却室の使用は、周囲のより正確な制御を提供します温度。冷却室でのペルチェ素子は、一定かつ均一テムを維持することができます実験を通してたは温度。古典的なセットアップでは、局所的な温度差は、異なる観測成果につながる可能性があります。古典的なセットアップは、特に温度を下げ、誘導された温度変化に非常にゆっくりと適応しながら、また、それは、温度誘導性の変化に迅速かつ迅速に対応することができます。冷却室でペルチェ素子はまた、15℃または40℃のような温度に到達すると、古典的なセットアップよりも広い温度範囲(15〜40°C)を覆うことができることは非常に困難です。
細胞性粘菌は、光毒性に特に敏感です。以前の研究では、光毒性を低減するために捕捉剤としてアスコルビン酸を使用します。しかし、長い撮影期間は追加の補充を必要とします。また、アスコルビン酸の使用が関心のメカニズムは抗酸化サプリメントの影響を受けていない研究に限定されています。我々は、温度制御されたイメージング代替APPRとして使用できることを提案しますoachは、光毒性を最小限にし、さらに、毒性を減少させるために、アスコルビン酸の添加と組み合わせることができます。
光毒性効果は、冷却室を使用して23℃の一定かつ均一な温度を提供することによって最小限に抑えることができます。温度制御を使用して画像化する細胞は、より長い期間のための光毒性は、そのような細胞の丸みの少ない徴候を示します。これはまた、より高い強度、より小さな時間間隔またはビュー(FOVの)の複数のフィールドでイメージングを可能にします。
一般的適用
高温での熱応力は、異なる熱ストレス応答14を誘発することが示されています。従って、34℃又は37℃に温度を上げると、異なる応答を誘導する可能性があります。適用温度ストレスに加えて、特定のストレス状態の持続時間は、応力を加熱するため、即時応答または長期適応を研究するために修飾することができます。
一般に、記載されたプロトコルをすることができますアプリケーションの広いセットに拡大しました。正確な温度制御がかなり光毒性効果を減少するため、プロトコルは、高い露光時間および/またはより高い励起光強度を必要とする設定などで、低い発現レベルでタンパク質を可視化するために、または短い時間間隔と組み合わせて使用することができますタイムラプスイメージングの間、 例えば 、イメージングの間。これらの設定は、光のzセクションの多数を必要とすることも、セル全体にわたるイメージング・オブジェクト、 例えば 、微小管のために有利であり得ます。
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |