The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Dictyostelium discoideum är ensam jorden levande amöbor som livnär sig på bakterier och andra mikroorganismer, som tas upp genom fagocytos. Den har en unik och märklig livscykel som har varit ett stort forskningsområde sedan dess upptäckt en. Den tidiga intresset för flercellig utveckling 2 och den molekylära grunden för kemotaxi 3 snart kompletteras med studier som fokuserar på cellrörlighet, cell polaritet, medfödd immunitet. Dessutom, D. ideum infördes som ett modellsystem för biomedicinsk forskning 4,5.
Nyligen har vi etablerat D. ideum som ett nytt system för att studera protein kvalitetskontroll (PQC) systemet 6,7. Dess proteom anrikas i aggregering benägna prionliknande proteiner, vilka utgör en utmaning för protein kvalitetskontroll 8. För att undersöka huruvida D. ideum har utvecklat speciella molekylära mekanismer för att kontrollera dess mycket agförsamlingens benägna proteom, studerade vi beteendet hos aggregering benägna markörproteiner både under normala tillväxtbetingelser och under stress. Stressbetingelser, såsom värmestress, kan användas för att öka hastigheten av protein misfolding 9. Därför sökte vi ett system där vi kunde förmå temperaturförändringar och samtidigt följa beteendet hos markörproteiner. För detta ändamål, kombinerade vi live-cell imaging med Peltier-kontrollerad uppvärmning användning av en termisk stadium insats (kylkammare). Denna metod tillät oss att upprätthålla en konstant och jämn temperatur samt för att inducera en snabb men ändå exakt temperaturändring.
Live-cell imaging används för att studera en mängd olika biologiska processer i D. discoideum. Emellertid inför denna metod två stora begränsningar. Först, cellerna uppvisar en hög motilitet och tenderar att migrera ut ur synfältet, vilket således spårning av individuella celler kräver ofta avbildning av ett stort område. Cell rörlighet kanminskas med agar 10, men dessa förhållanden är inte lämpliga för långtids avbildning på grund av en nedgång i lönsamheten. För det andra, D. discoideum-celler visar en särskilt hög känslighet till foto-toxicitet, vilket resulterar i cell avrundning och mitotiska gripande 11. Tidigare protokoll upp denna fråga genom tillsats av askorbat som en radikal renhållare och begränsning av exponering gånger 12. Den senare kan vara kritisk om proteinet av intresse uttrycks vid låga nivåer och visar en svag fluorescenssignal. Författarna föreslår också att ge en konstant temperatur på 21 ° C, antingen genom avbildning i ett luftkonditionerat rum eller genom att använda temperaturreglerade inkubation lådor, som täcker målet och mikroskop scenen 12.
Här beskriver vi en metod med förbättrad temperaturkontroll genom att använda en kylnings kammare inställd på 23 ° C. Under avbildning vår set-up avsevärt förbättrar motståndet mot fototoxicitet. Detmöjliggör användningen av högre gånger exponering och högre excitation ljusintensiteter. Detta är särskilt viktigt under time-lapse avbildning, eftersom tidsintervall måste vara väl avvägd mot antalet positioner avbildas och exponeringstiden som används. Möjligheten att öka antalet avbildade positioner tillåter också täckning av ett större bildyta och underlättar spårning av individuella celler under en längre tidsperiod.
Protokollet som beskrivs här kan användas för att studera beteendet hos ett speciellt protein av intresse som svar på värmeinducerad påkänning. Temperaturökning till 30 ° C har rapporterats att utlösa värme stressvar och under dessa betingelser livskraft D. ideum minskas markant.
modifieringar
Protokollet kan modifieras för att jämföra beteendet hos olika proteiner under samma spänningsförhållanden. För detta är celler som uttrycker olika proteiner med samma fluorescerande taggen överförs till flera brunnar, såsom fyra kammarrätter (avsnitt 1.3.1). Protokollet kan också appliceras på celler som samuttrycker proteiner med olika markörer, såsom GFP eller RFP. Detta kan vara till exempel användas för att övervaka beteendet hos olika komponenter av protein kvalitetskontroll (PQC) -system. Celler som uttrycker GFP-märkta aggregering markör och olika RFP-märkta PCQ komponenter kan observeras med hjälp av flera brunnarkupade för avbildning. Detta säkerställer samma spänningsförhållanden (hastighet av temperaturökning / minskning, varaktighet temperatur ökning / minskning) och gör det möjligt för jämförande studier.
Dessutom kan protokollet användas för att studera inverkan av PQC systemet på värmestressrespons. Aktiviteten av komponenterna kan moduleras genom att ändra expressionsnivåer med användning av genetiska verktyg såsom knock-out eller överuttryck eller genom användning av kommersiellt tillgängliga specifika inhibitorer 6. Proteasomen kan hämmas genom tillsats av MG132 (100 pM) eller lactacystin (10 ^ M) till tillväxtmediet. Kaperonet Hsp90 kan inhiberas med hjälp av geldanamycin (6 M) eller radicicol (10 M). Kaperonet Hsp70 kan hämmas med VER-155.088, även om vi inte kunde bekräfta effekten av inhiberingen i våra experimentella inställningar hittills. Hämmare bör läggas en dag innan avbildning och cellerna inkuberas under 14 h.
Criti cal steg inom protokollet
Det kritiska steget för bedömning av värmeinducerad störningen är tillståndet av cellerna före avbildningsexperiment. Studier i jäst visade att celler förvärvar resistens mot ett antal olika stressfaktorer i omgivningen under den stationära fasen 13. Vi observerade också minimal känslighet för tillämpad värmestress om D. discoideum celler hade nått stationär fas före avbildning. Därför upprätthåller en konstant celltal <5 x 10 5 celler / ml kritisk.
Dessutom kan höga cellantal inducerar övergång från den vegetativa cykeln D. ideum till utvecklingscykeln, vilket utlöser svält vägar, vilket kan leda till ett annat svar på värmestress. Om höga cellantal uppnås i återhämtningsfasen efter värmestress, streaming och aggregerande celler kan störa dataanalys som cellerna flytta ut ur fokus (se Figur 4).
innehåll "> Begränsning av tekniken Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga metoder
I jämförelse med befintliga inställningar såsom användning av luftkonditionerade rum, temperaturreglerade inkubation lådor som omfattar mål och mikroskop scenen eller temperaturreglerade stadier och objektiva kragar, tillhandahåller användningen av en kylkammare en mer noggrann kontroll av den omgivande temperatur. Peltier-elementet i kylkammaren kan upprätthålla en konstant och likformig temperatur hela experimentuppställning. I klassiska uppställningar, kan skillnader lokala temperatur leda till olika observationsresultat. Dessutom kan den reagera snabbt och snabbt till inducerade förändringar i temperatur, medan klassiska uppställningar anpassa sig mycket långsamt till inducerade temperaturförändringar, särskilt sänkning av temperaturen. Peltier-elementet i kylkammaren kan också omfatta ett bredare temperaturområde (15-40 ° C) än klassiska uppställningar, som når temperaturer såsom 15 ° C eller 40 ° C är mycket svårt.
Dictyostelium discoideum är särskilt känslig för fototoxicitet. Tidigare studier använde askorbat som rensare att reducera foto-toxicitet. Men långa avbildningstider kräver ytterligare tillskott. Dessutom är användningen av askorbat begränsad till studier där mekanismen av intresse inte påverkas av antioxidant tillägg. Vi föreslår att temperaturstyrd avbildning kan användas som ett alternativ ca.oach att minimera foto toxicitet och skulle kunna kombineras med tillsats av askorbat för att ytterligare minska toxicitet.
Fototoxiska effekter kan minimeras genom att tillhandahålla en konstant och likformig temperatur av 23 ° C med användning av en kylkammare. Celler avbildas med temperaturkontroll visar färre tecken på fototoxicitet, såsom cell avrundning, för en längre tidsperiod. Detta gör också avbildning med högre intensitet, mindre tidsintervall eller flera synfält (FOVs).
Allmänt Applikation
Värmestress vid högre temperaturer har visat sig utlösa ett annat värmestressrespons 14. Därför kan ökning av temperaturen till 34 ° C eller 37 ° C inducerar ett annat svar. Utöver den pålagda temperaturstress, kan varaktigheten för en viss stressituation modifieras för att studera den omedelbara responsen eller långvarig anpassning till värmestress.
I allmänhet kan de beskrivna protokollexpanderas till en bred uppsättning program. Eftersom exakt temperaturstyrning minskar fototoxiska effekter avsevärt kan protokollet användas i miljöer som kräver höga exponeringstider och / eller högre exciterings Ijusintensiteter, t.ex. för att visualisera proteinerna med en låg uttrycksnivå, eller i kombination med korta tidsintervall mellan avbildning, t ex under time-lapse avbildning. Det kan också vara fördelaktigt för avbildning föremål som spänner över hela cellen, t ex, mikrotubuli, eftersom dessa inställningar kräver ett stort antal optiska z-sektioner.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |