The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Diktiyostelyum diskodeyum fagositozu tarafından alınır bakteri ve diğer mikroorganizmaların, beslenen yalnız toprak yaşayan amipler vardır. Onun keşfinden 1 yılından bu yana araştırma önemli bir alan olmuştur eşsiz ve olağanüstü yaşam döngüsü vardır. Çok hücreli gelişim 2 ve kemotaksis 3 moleküler temeli erken faiz yakında hücre hareketi, hücre polarite, doğuştan bağışıklık odaklanarak çalışmalarla tamamlanmaktadır. Buna ek olarak, D. diskodeyum biyomedikal araştırma 4,5'ten için bir model sistem olarak tanıtıldı.
Son zamanlarda, biz D. kurdu diskodeyum protein kalitesi kontrolü (PQC) sistem 6,7 incelemek için yeni bir sistem olarak. Onun proteom protein kalite kontrolü 8 bir sorun teşkil etmektedir toplama eğilimli prion-benzeri proteinler, zenginleşmektedir. D. olup olmadığını araştırmak diskodeyum onun son derece ag kontrol etmek için özel moleküler mekanizmaları geliştirmiştirgregation eğilimli proteom, normal gelişim koşulları altında ve stres esnasında her iki çekiş eğilimli markör proteinlerin davranışı incelenmiştir. Bu tür ısı stres gibi stres koşulları, protein 9 yanlış katlayan oranını artırmak için kullanılabilir. Bu nedenle, biz sıcaklık değişikliklere neden ve aynı zamanda işaretleyici proteinlerin davranışını takip edebilecek bir sistem arıyordu. Bu amaçla, bir ısıl aşama uç (soğutma odası) kullanılarak Peltier kontrol ısıtılarak canlı hücre görüntüleme birleştirildi. Bu yöntem sürekli ve üniform bir sıcaklığı korumak hem de hızlı bir şekilde, ama kesin bir sıcaklık değişimine neden izin verdi.
Canlı hücre görüntüleme D. biyolojik süreçlerin çeşitli incelemek için kullanılır diskodeyum. Ancak, bu yaklaşım iki önemli sınırlamalar ile karşı karşıyadır. İlk olarak, hücreler böylece bireysel hücrelerin izleme, yüksek hareket kabiliyeti göstermek ve görüş alanının dışına göç eğilimi genellikle geniş bir alanın görüntüleme gerektirir. Hücre hareketlilik olabilirAgar bindirme 10 azaltılabilir, ancak bu koşullar nedeniyle canlılığı bir azalmaya ve uzun vadeli görüntüleme için uygun değildir. İkinci olarak, D. discoideum hücreler, hücre yuvarlama ve mitotik durması 11 sonuçlanan verilmedi-toksisite için özellikle yüksek bir duyarlılık göstermektedir. Önceki protokoller bir kök sürükleyici ve maruz kalma süreleri 12 azaltılması gibi askorbat ilave edilerek bu sorunu ele aldı. İlgili protein düşük seviyelerde sentezlendiği ve zayıf bir floresan sinyalini göstermektedir olan ikinci kritik öneme sahip olabilir. Yazarlar ayrıca, klimalı odada görüntüleme ya da nesnel ve mikroskop sahne 12 kapak sıcaklık kontrollü kuluçka kutuları kullanarak ya 21 ° C sabit sıcaklık sağlamak öneririz.
Burada, 23 ° C'de bir soğutma odası kullanılarak, geliştirilmiş sıcaklık kontrollü bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim set-up görüntüleme sırasında önemli ölçüde foto-toksisite direncini artırır. Oyüksek pozlama süreleri ve daha yüksek uyarma ışık şiddetlerinin kullanımını sağlar. zaman aralıkları görüntülü pozisyonların sayısı ve kullanılan poz zamana karşı dikkatle dengelenmiş olması gerekir gibi bu, time-lapse görüntüleme sırasında özel bir önem taşımaktadır. görüntülü pozisyonların sayısının artırılması olanağı da daha geniş bir görüntüleme alanının kapsamı izin verir ve daha uzun bir süre boyunca tek tek hücrelerin izleme kolaylaştırır.
Burada açıklanan protokol ısı stresine yanıt olarak, ilgilenilen özel bir proteinin davranışını incelemek üzere kullanılabilir. 30 ° C sıcaklık artışı sıcaklık stresi yanıt tetiklemek için bildirilen ve D, bu koşullar altında yaşayabilirliği edilmiştir diskodeyum belirgin azalır.
Değişiklikler
Protokol, aynı stres koşulları altında farklı proteinler davranışını görmek için değiştirilebilir. Bu, aynı flüoresan etiketle farklı proteinler ifade eden hücreler, örneğin dört odacık tabaklar (bölüm 1.3.1) halinde, çok oyuklu tabaklara aktarılır. protokol, örneğin GFP veya RFP gibi farklı belirteçler, proteinler ko-eksprese eden hücreler üzerinde de uygulanabilir. Bu protein kalite kontrolü (PQC) sisteminin farklı bileşenleri davranışını izlemek için kullanılan, örneğin olabilir. GFP etiketli agregasyon Marker farklı TTT-etiketli PCQ bileşenleri ifade eden hücreler çok çukurlu kullanılarak gözlenebilirgörüntüleme için bombeli. Bu, aynı stres koşulları (sıcaklık artışı / azalması, sıcaklık artış / azalış süresi hız) sağlar ve karşılaştırmalı çalışmalar için izin verir.
Ayrıca protokol sıcaklık stresi yanıtına PQC sisteminin etkisini incelemek için kullanılabilir. Bileşenlerin etkinlik, knock-out veya aşırı ekspresyonu genetik araçlar kullanılarak ifade seviyeleri değiştirerek veya ticari olarak temin edilebilen özel inhibitörleri 6 ile modüle edilebilir. proteazom büyüme ortamına MG132 (100 uM) ya da Laktasistin (10 uM) ilave edilerek engellenebilmektedir. şaperon Hsp90 geldanamisin (6 uM) ya da radicicol (10 uM) kullanılarak inhibe edilebilir. Şimdiye kadar bizim deneysel ortamlarda inhibisyon etkinliğini teyit edemeyeceğini, ancak hastabakıcı Hsp70, VER-155088 ile inhibe edilebilir. İnhibitörler görüntüleme bir gün önce eklenmelidir ve hücreler 14 saat daha inkübe edilir.
great.Thanks Protokol çerçevesinde cal Adımlar
Isı kaynaklı pertürbasyonun değerlendirilmesi için kritik adım görüntüleme deney öncesinde hücrelerin durumudur. Mayada çalışmalar Hücreler durağan aşamaya 13 boyunca çevresel strese çeşitli direnci elde gösterdi. Biz de D. ise uygulanan ısı stresi minimum tepki gözlendi diskodeyum hücreleri önce görüntüleme sabit faz ulaşmıştı. Bu nedenle, sabit bir hücre sayısı elde <5 x 10 5 hücre / ml kritiktir.
Ayrıca, yüksek hücre sayısı D vejetatif döngüsü geçiş indükleyebilir böylece sıcak stresine farklı bir tepki yol açabilecek açlık yolları, tetikleme, gelişimsel döngüsüne diskodeyum. Yüksek hücre sayıları ısı stresi, akarsu sonrası iyileşme aşamasında ulaşılır ve hücreler odak dışında hareket olarak toplayarak hücreler veri analizi ile müdahale durumunda (bakınız Şekil 4).
içerik "> Tekniği Sınırlaması Mevcut Yöntemlerine Göre Tekniği Önemi
Böyle klimalı odalarda, amaçlarını ve mikroskop sahne veya sıcaklık kontrollü aşamaları ve objektif yaka kapsayan sıcaklık kontrollü kuluçka kutuları kullanımı gibi mevcut kurulumları ile karşılaştırıldığında, bir soğutma odası kullanımı ortam daha hassas kontrol sağlar sıcaklık. soğutma bölmesi içinde Peltier parçası sabit ve muntazam bir TEM korumakdeney düzeneği boyunca lığı. Klasik kurulumları, yerel sıcaklık farklılıkları, değişik gözlem sonuçlarına yol açabilir. Klasik kurulumları özellikle sıcaklığının düşürülmesi, uyarılmış sıcaklık değişikliklerine çok yavaş adapte ederken Dahası, sıcaklık kaynaklı değişikliklere çabuk ve hızlı cevap verebilir. soğutma bölmesi içinde Peltier parçası, aynı zamanda, 15 ° C ya da 40 ° C olarak ulaşan sıcaklıklarda çok zor olan klasik kurulumları daha geniş bir sıcaklık aralığı (15-40 ° C) kapsayabilir.
Dictyostelium discoideum verilmedi-toksisiteye özellikle duyarlıdır. Önceki çalışmalar foto-toksisitesini azaltmak için süpürücü olarak askorbat kullanılır. Ancak, uzun görüntüleme süreleri ek takviyesi gerektirir. Ayrıca, askorbat kullanımı ilgi mekanizması antioksidan takviyesi etkilenmez çalışmalar sınırlıdır. O sıcaklık kontrollü bir görüntüleme alternatif yakl olarak kullanılabilir teklifoach verilmedi-toksisiteyi en aza indirmek için ve daha fazla toksisite azaltmak için askorbat eklenmesiyle birleştirilebilir.
Fototoksik etkilerini bir soğutma odası kullanılarak 23 ° C'lik bir sabit ve muntazam bir ısı sağlanarak en aza indirilebilir. Sıcaklık kontrolü kullanarak görüntülü hücreler daha uzun bir süre için foto-toksisite, hücre yuvarlama az belirtileri göstermektedir. Bu aynı zamanda yüksek şiddetlerde küçük zaman aralıkları veya görünümü (FOVs) daha fazla alanları ile görüntüleme sağlar.
Genel Başvuru
Daha yüksek sıcaklıklarda ısı stres farklı ısı stres yanıtı 14 tetiklemek için gösterilmiştir. Bu nedenle, 34 ° C ya da 37 ° C sıcaklığının artırılması başka bir yanıtı ortaya çıkarabilir. uygulanan sıcaklık stresine ilaveten, belli bir yük durumu süresi sıcak stresine hemen yanıt ya da uzun süreli uyum incelemek için modifiye edilebilir.
Genel olarak, açıklanan protokol olabilirgeniş bir uygulama seti genişletilmiş. Hassas sıcaklık kontrolü önemli verilmedi toksik etkilerini azalttığı için, iletişim kuralı, ya da kısa aralıklarla ile bir arada, düşük ekspresyon düzeyi ile protein görselleştirmek için, örneğin, yüksek etki süreleri ve / veya daha yüksek uyarım ışık şiddetleri, gerektiren işlerde kullanılır time-lapse görüntüleme sırasında görüntüleme, örneğin, arasındadır. Aynı zamanda tam hücre kapsayan nesneleri görüntüleme için avantajlı olabilir, örneğin, mikrotübül, bu ayarlar optik z bölümlerin yüksek sayıda gerektiren.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |