Descriviamo un protocollo per la filtrazione di campioni d'acqua con una cartuccia filtrante e l'estrazione del DNA ambientale (eDNA) senza dover aprire l'alloggiamento per rimuovere il filtro. Questo protocollo è stato sviluppato per il metabarcoding dell'eDNA dei pesci, ma è applicabile anche all'eDNA di altri organismi.
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Articolo metodologico
L'utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studi recenti hanno dimostrato che l'uso del DNA ambientale (eDNA) dei pesci è appropriato come strumento di monitoraggio non invasivo. La maggior parte di questi studi ha impiegato filtri a fibra di disco per raccogliere l'eDNA da campioni d'acqua, sebbene un certo numero di studi microbici in ambienti acquatici abbiano impiegato cartucce filtranti, perché la cartuccia ha il vantaggio di ospitare grandi volumi d'acqua e di una generale facilità d'uso. Qui forniamo un protocollo per la filtrazione di campioni d'acqua utilizzando la cartuccia filtrante e l'estrazione di eDNA dal filtro senza dover aprire l'alloggiamento. Le parti principali di questo protocollo consistono in: 1) filtrazione di campioni d'acqua (volumi d'acqua ≤4 L o >4 L); (2) estrazione del DNA sul filtro mediante uno scuotitore a rulli posto in un'incubatrice preriscaldata; e (3) purificazione del DNA utilizzando un kit commerciale. Con l'uso di questo protocollo e di quelli utilizzati in precedenza, eseguiamo l'analisi del metabarcoding dell'eDNA prelevato da un'enorme vasca d'acquario (7.500 m3) con composizione di specie nota e mostriamo il numero di specie rilevate per libreria dai due protocolli come risultati rappresentativi. Questo protocollo è stato sviluppato per il metabarcoding dell'eDNA dei pesci, ma è applicabile anche all'eDNA di altri organismi.
Introduzione
DNA ambientale (Edna) in ambienti acquatici si riferisce a materiale genetico trovato nella colonna d'acqua. Recenti studi hanno dimostrato l'utilità di Edna per la rilevazione di pesci da vari ambienti acquatici, tra stagni, fiumi 1-3 4-8, torrenti 9, e l'acqua di mare 10-14. La maggior parte di questi studi si sono concentrati sulla individuazione di un unico o pochi invasivo 1,4-6,8,14 e rare o minacciate specie di 3,9, mentre alcuni studi recenti hanno tentato il rilevamento simultaneo di più specie in comunità ittiche locali 7,9, 12,13,15 e mesocosmi 11,12.
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo non si occupa di metodi di campionamento e di acqua metabarcoding. L'acqua può essere campionato in modi diversi a seconda fini di studio 16 e vedere Miya et al. 12 per i dettagli sui metodi metabarcoding utilizzando primer MiFish. Si noti che l'acqua campione deve essere mantenuto molto freddo e filtrato entro poche ore per evitare la degradazione di Edna. Si noti inoltre che questo protocollo prevede l'utilizzo di un agitatore rotativo e un incubatore, e quest'ultimo deve essere sufficientemente grande per accogliere il primo. Inoltre, una centrifuga che può ospitare anche 15 ml e 50 ml provette....
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Risultati
È tecnicamente difficile isolare e quantificare solo Edna pesce dal Edna massa estratta, perché i primer MiFish coamplify la regione di destinazione da parte di alcuni vertebrati non-pesce, come uccelli e mammiferi, con prodotti di PCR della stessa dimensione (ca. 170 bp ) 12. Invece di quantificare pesce Edna, eseguiamo MiFish metabarcoding analisi di Edna da un serbatoio acquario con nota la composizione delle specie utilizzando i due diversi metodi di filtraggio e .......
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Discussione
In molti studi metabarcoding utilizzando campioni ambientali come l'acqua e il suolo, il trattamento post-filtrazione della cartuccia filtrante è generalmente come segue 24,25: 1) taglio aperto e screpolature della custodia con utensili manuali (taglio per tubi o pinze); 2) la rimozione del filtro dalla cartuccia; e 3) taglio del filtro in piccoli pezzi con una lametta per l'estrazione del DNA. Per evitare tali diversi metodi di estrazione del DNA ingombrante e richiede tempo procedure che sono sogget.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato come ricerca di base da CREST dall'Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia (JST) e da sovvenzioni da JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) e dalla Canon Foundation a M.M. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pannello in rete | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Polo in metallo | Iris Ohyama | MR12F | |
| Supporto per il pannello in rete | N. marca | 4184-9507 | disponibile su Amazon Giappone |
| Sacchetto di plastica da 1 L con tappo a vite | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Connettore luer-lock maschio | ISIS | 11620 | |
| Puntale per pipetta da 10 ml | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| Bottiglia libro da 10 L con valvola | As One | 1-2169-01 | |
| Filtro Sterivex-HV | Millipore | SVHVL10RC | indicato come "cartuccia filtrante" in tutto il ms e utilizzato nel protocollo |
| Raccordo luer maschio | As One | 1-7379-04 | |
| Raccordo luer femmina | As One | 5-1043-14 | |
| Tappo luer di ingresso | ISIS | VRMP6 | |
| Tappo luer di uscita | ISIS | VRFP6 | |
| Tubo ad alto vuoto | As One | 6-590-01 | |
| Connettore per vuoto | As One | 6-663-02 | |
| Tappo in silicone | As One | 1-7650-07 | |
| Collettore | As One | 2-258-01 | |
| Aspiratore-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Kit di tessuti (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex Kit di isolamento del DNA | MO BIO | 14600-50-NF | indicato come "kit opzionale" nella |
| ms Centrifuga da tavolo | Kubota | Modello 4000 | Velocità massima 6.000 giri/min |
| Rotore ad angolo fisso | Kubota | AT-508C | |
| Adattatore per una provetta conica da 15 ml | Kubota | 055-1280 | |
| Soluzione di stabilizzazione RNAlater | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | indicato come "film autosigillante" |
Riferimenti
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE....
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Ristampe e permessi
