This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
Manter a integridade seção planta é essencial para estudar estruturas anatômicas detalhadas no celular, tecido ou até mesmo nível do órgão. No entanto, algumas células de plantas têm paredes celulares rígidas, fibras duras e cristais (oxalato de cálcio, sílica, etc), e elevado teor de água que muitas vezes perturbar a integridade do tecido durante o corte do tecido da planta.
Este estudo estabelece um método de corte de tecido Cut-híbrido simples. Este protocolo modifica uma técnica de corte à base de parafina e melhora a integridade das secções de tecido a partir de plantas diferentes. tecidos de plantas foram embebidos em parafina antes de seccionamento num crióstato a -16 ° C. Seccionamento sob a baixa temperatura endurecido os blocos de parafina, reduzida lacrimejamento e coçar, e melhorou a integridade do tecido de forma significativa. Este protocolo foi aplicado com sucesso em tecidos ricos em oxalato de cálcio Phalaenopsis orquídeas, bem como tecidos recalcitrantes, como orga reprodutivaNS e folhas de arroz, milho e trigo. Além disso, a elevada qualidade de secções de tecido a partir de híbrido-corte pode ser utilizado em combinação com a hibridização in situ (ISH) para proporcionar os padrões de expressão espaciais dos genes de interesse. Em conclusão, este protocolo é particularmente útil para tecido vegetal recalcitrante contendo alta cristal ou teor de sílica. Bons cortes de tecidos de qualidade permitir estudos biológicos morfológicas e outros.
O método de corte à base de parafina é uma técnica amplamente utilizada para estudos anatómicos. Preservação da anatomia tecido intacto é importante para estudos morfológicos e biológicos. A técnica de corte em parafina é vantajosa porque a parafina incorporação retém a morfologia celular e do tecido. Além disso, os blocos de parafina pode ser convenientemente armazenado por longos períodos de tempo. No entanto, o seccionamento embebido em parafina não é adequado para tecidos de plantas contendo cristais intracelulares. Cristais dentro das células, muitas vezes rasgar fitas de parafina e integridade do tecido danos durante o corte.
Ao contrário de seccionamento de parafina, cryosectioning é relativamente rápido e secções pode ser obtido sem a fixação, a desidratação de série ou a incorporação de um meio de infiltração. Criocortes são compatíveis com muitas aplicações, tais como imuno-histoquímica, hibridação in situ, e histoquímica enzima. A outra vantagem de cryosectioning éque este método não passam por um potencial de processos de desnaturação tais como temperaturas elevadas e tratamentos químicos, moléculas tão celulares são bem preservada dentro das secções de tecido 2. Cryosectioning é geralmente preferida em relação com base em parafina para seccionamento estudos em tecidos animais. No entanto, cryosectioning não é a primeira escolha em plantas, porque temperatura de congelamento, por vezes, provoca a formação de cristais de gelo que afetam a qualidade da integridade seção. Embora osmoregulação tais como soluções de sacarose, polietileno glicol (PEG), ou glicerol-3 têm sido relatados para reduzir a formação de cristal de gelo sob condições de congelamento, a melhoria é menos do que óptima.
Para se adaptar a diferentes ambientes, plantas diferentes têm muitas vezes células textura do tecido e vegetais distintas evoluíram para formar paredes rígidas celulares, fibras duras, e cristais de 4,5. Por exemplo, insolúveis cristais de oxalato de cálcio e corpos de sílica são bastante comuns naplantas 6. Corpos de silicato / cristais foram relatados para ajudar a manter a arquitectura da planta, verticalidade, e prevenir a doença ou de pragas em plantas de cereais 7-9.
As orquídeas em vasos e mercado de orquídea de flores de corte é florescente e é uma indústria crescente. Aphrodite de Phalaenopsis (orquídea de traça) é um dos mais importantes de exportação de plantas ornamentais em Taiwan. Esforços significativos têm sido feitos para entender as mudanças morfológicas e fisiológicas dos processos de florescência no orquídeas Phalaenopsis. Hastes florais de orquídeas Phalaenopsis são iniciadas a partir de gemas axilares na base da folha. Após um período de temperatura ambiente fresco (cerca de um mês e meio), gemas axilares ampliar, quebra de dormência, e se projetam a partir da base da folha de evoluir para jovens hastes florais. Para entender a fisiológica, celular e processos moleculares de iniciação pico, é essencial para desenvolver uma técnica anatômica robusta para Visuatecidos ou marcadores Lize em tempo hábil. No entanto, a presença de cristais onipresentes em tecidos de orquídeas, particularmente em gemas axilares, torna o trabalho anatômica difícil.
Aqui procuramos melhorar a integridade seção de tecidos de plantas recalcitrantes que até agora têm sido consideradas tecnicamente desafiador. Aqui nós mostramos um protocolo melhorado chamado Hybrid-Cut. É um método de corte à base de parafina, que é realizado utilizando um criostato. inclusão em parafina resolve alto teor de água no tecido vegetal. Seccionamento sob a baixa temperatura endurece o bloco de parafina, reduz cristal rasgando problema, e melhora a integridade do tecido de forma significativa. Este protocolo melhora significativamente a integridade do tecido de amostras de plantas recalcitrantes.
As células vegetais têm paredes rígidas celulares, fibras duras, cristais e elevado teor de água que causam problemas rasgar o tecido durante o corte de tecidos vegetais. Apesar de corte à base de parafina é frequentemente utilizado para tecidos de plantas, muitas vezes os cristais endógenos dilacerar o tecido da planta durante o corte (Figura 1). Devido ao teor de água elevado inerentemente dentro das células da planta, corte com base em criostato muitas vezes faz com que as células quebradas e secções de tecido rachadas.
No presente estudo, um protocolo de parafina-incorporação e criocorte combinado chamado Hybrid-Cut foi desenvolvido e bons cortes de tecidos de qualidade foram obtidos. Este protocolo resolve o problema associado com elevado teor de água através da introdução de inclusão em parafina, e reduz o efeito de arrancamento por endurecimento da cera de parafina sob baixa temperatura durante o corte (Figura 3). Portanto, este protocolo modificado é vantajoso sobre qualquer sectio à base de parafinaning ou cryosectioning para preservar a integridade do tecido da planta.
Este manuscrito demonstra que o método híbrido-Cut preserva a integridade do tecido, em muitos tecidos de Phalaenopsis tais como gema axilar, sementes, e PLB, etc, que contêm níveis elevados de cristais (Figuras 3-4). Além disso, este protocolo é passível de colheitas de cereais tais como órgãos reprodutores e folhas de arroz, milho e trigo, que contêm elevado teor de sílica (Figuras 5-6). Presumivelmente, este protocolo pode ser aplicado a plantas lenhosas que contêm alto teor de fibras.
Em geral, o tecido completamente fixação é muito importante para o Híbrido-Cut. Descobrimos que fixador ácido-álcool formaldeído-ácido (FAA) é melhor do que o PFA para preservar a integridade do tecido de alguns tecidos tais como botões recalcitrantes axialmente, raízes, etc. No entanto, PFA funciona melhor do que FAA na preservação da integridade do RNA. Portanto PFA é recomendado para corrigiramostra para hibridação in situ trabalho (ISH). O protocolo aqui descrito é projetada para a experiência RNA ISH. Por isso, foram preparados todos os reagentes para evitar a degradação do RNA, eliminando a contaminação RNase por tratamento DEPC. Se secção Hybrid-Cut é para estudos anatômicos, osmose reversa água normal (RO) e seu tampão ou reagentes derivados são aceitáveis.
Reduzindo o tamanho da amostra e a espessura inferior a 3 mm é útil para a infiltração. Além disso, aumentando o tempo de imersão para a desidratação e infiltração são necessárias para tecidos de textura dura. Limitação deste protocolo pode devido a problemas causados pela fixação inadequada, desidratação e infiltração de amostra. Portanto, o ajuste de tempo de processamento para cada etapa é fundamental para a produção de blocos de parafina de boa qualidade. Normalmente, o tecido mais precisa de mais tempo de processamento do que o tecido mais macio.
Além disso, mostramos que a Hybrid-Cut trabalhado com sucesso em combinação with ISH para proporcionar uma distribuição espacial dos transcritos seleccionados (figura 7). Em resumo, este protocolo é útil para o estudo da anatomia da planta e fornece um mapa de ARN específico do tecido dos genes seleccionados. Além disso, pode ser aplicado a outros estudos moleculares, tais como ensaio de transferase terminal de desoxinucleotidilo marcação terminal dUTP nick (TUNEL), hibridação in situ fluorescente (FISH), e técnicas de imunocoloração. Em conclusão, este melhorada protocolo de seccionamento de tecidos é útil e útil para pesquisadores em comunidades de plantas.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |