Summary
Подробный порядок синтеза 125 I-меченого азида и радиомечения из dibenzocyclooctyne (DBCO) -группа-сопряженными, 13-нм размера наночастиц золота с использованием меди , свободной от реакции щелчка описана.
Protocol
Внимание: окисленная форма радиоактивного йода довольно неустойчив и должны быть обработаны с адекватными свинцовыми щитами и свинцовых флаконах. Все радиохимических шаги должны проводиться в хорошо вентилируемом активированным углем капот, а также экспериментальные процедуры должны контролироваться устройствами обнаружения радиоактивности.
1. Приготовление химических веществ и обратного фазового картриджа для синтеза 125 I-меченого азида
- Приготовление реагентов в растворе
- Растворите 1 мг азида предшественника (2) в 150 мкл абсолютного этилового спирта (рисунок 1).
Примечание: Подробное синтетическая процедура предшественника азида (2) сообщалось в предыдущей статье 22. - Растворите 1 мг хлорамина T в 20 мкл 1х фосфатного буфера солевым раствором (рН = 7,4).
- Растворите 2 мг метабисульфит натрия в 20 мкл H 2 O.
- Растворите 1 мг азида предшественника (2) в 150 мкл абсолютного этилового спирта (рисунок 1).
- PREPARAции картриджа
- Промыть картридж tC18 с 10 мл абсолютного этанола , а затем 10 мл H 2 O. Не сушить матрицу картриджа с воздухом.
2. Radiosynthesis 125 I-меченого азида ортопедической группы
- Радиоиодирования реакции предшественника
- Добавляют раствор предшественника азид (1 мг в 150 мкл абсолютного этанола) и уксусную кислоту (10 мкл) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Добавьте 150 МБк [125 I] NaI в 0,1 М NaOH (50 мкл) к реакционной смеси.
- Добавление хлорамин Т раствор (1 мг в 20 мкл 1х фосфатного буферного раствора) и закройте микроцентрифужных пробирку, содержащую реакционную смесь.
- Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 15 мин, пока реакция радиоиодирования не будет завершена.
- Добавление метабисульфит натрия (2 мг в 20 мкл H 2 O) к реакционной смеси ,для гашения реакции радиоиодирования.
- Вывод 0,2 мкл неочищенного продукта , а затем разбавить его 100 мкл раствора (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) для анализа ВЭЖХ.
Примечание: Для всех экспериментов ВЭЖХ используют 0,1% муравьиной кислоты , содержащей H 2 O (растворитель А) и 0,1% кислоты , содержащей ацетонитрил муравьиную (растворитель B) в качестве растворителей. - Анализ разбавленный сырой продукт с помощью обращенно-фазовой аналитической радио-ВЭЖХ (С18 с обращенной фазой; скорость потока: 1 мл / мин, элюент градиент: 20% растворител в течение 0-2 мин, 20-80% растворител для 2-22 мин, 80-100% растворител в течение 22-23 мин, и 100% растворителя в в течение 23-28 мин; время удерживания: 16,4 мин) (рисунок 2).
- После очистки сырого продукта с помощью препаративной ВЭЖХ
Примечание: Обеспечить достаточное количество свинца экранирование вокруг ВЭЖХ частей, таких как инжектор, колонка, детектор, сбор флаконов, и контейнером, в котором собирается выходящий поток.- Вывод-йе Всю реакционную смесь в ВЭЖХ емкость. Ополосните реакционную трубку с ацетонитрилом (0,5 мл) и добавляют полоскание в том же флаконе для инъекций. Развести собранный раствор с H 2 O (1 мл).
- Вводят сырой продукт на препаративной радио-ВЭЖХ (С18 с обращенной фазой; скорость потока: 10 мл / мин; элюирование с градиентом: 20% растворител в течение 0-2 мин, 20-80% растворител в течение 2-22 мин, 80-100% растворител в течение 22-23 мин, и 100% растворител в течение 23-28 мин).
- Собирают радиоактивный пик , представляющий 125 I-меченый азид (1) (T R в этих условиях ВЭЖХ 17.8-18.8 мин) в стеклянной пробирке (рисунок 2).
- Измерьте радиохимический выход фракции с использованием радиоактивной дозы калибратор в соответствии с протоколом производителя.
- Вводят очищенного продукта на аналитическую радио-ВЭЖХ с использованием тех же условиях ВЭЖХ для определения радиохимической чистоты продукта.
- Твердофазной экстракции продукта
- Развести фракцию , содержащую целевой продукт реакции (1) с 40 мл чистого H 2 O.
- Добавьте разбавленный раствор в переобусловленного tC18 картриджа.
- Промыть картридж с дополнительным 15 мл H 2 O.
- Элюции продукт (1) запертых в картридже с 2 мл ацетона в 10 мл стеклянную пробирку, которая защищена свинцовым экраном. Измерьте радиоактивность элюированного продукта с использованием радиоактивной дозы калибратор в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: диметилсульфоксиде (ДМСО) или абсолютный этанол также может быть использован для элюирования продукта из картриджа. Примерно 5-10% радиоактивности обычно прилипает к патрону, а оставшийся радиоактивно меченный продукт не может быть полностью элюировали с использованием избыточных количеств органического растворителя. - Выпаривают ацетон с потоком азота или газообразного аргона.
- Растворить повторноsidue с ДМСО (100-200 мкл) на следующей стадии радиоактивной.
3. Синтез DBCO-группа-сопряженного наночастиц золота
- Поверхностная модификация 13-нм размера наночастиц золота с DBCO-группы , содержащей полиэтиленгликоль
- Готовят натрия цитрат-стабилизированные наночастицы золота (3) (средний размер = 13 нм) , в соответствии с предыдущим докладе 24.
- Добавление водного раствора Tween 20 (1 мМ, 1,5 мл) к цитратной-стабилизированных наночастиц золота (10 нМ, 15 мл). Взболтать раствор в течение 20 мин на орбитальном шейкере.
- Добавьте водный раствор DBCO-группы, содержащей полиэтиленгликоль тиола (средняя молекулярная масса = 5000, 100 мкМ, 1,5 мл). Встряхнуть раствор в течение 2 ч на орбитальном шейкере.
- Очистка наночастиц золота с модифицированной DBCO-группы,
- Очищают модифицированные DBCO-группы-наночастицы золота (4) </ Сильный> путем последовательного центрифугирования (11400 XG, 15 мин х 3).
- Слейте супернатант и добавить чистую воду для взмучивания золотых наночастиц гранул.
4. радиоактивной из DBCO-модифицированной группы наночастиц золота через неомедненная Нажмите реакции
- Синтез 125 I-меченных наночастиц золота с использованием 125 I-меченый азид (1)
- Приготовить концентрированный раствор наночастиц золота модифицированного DBCO-группы, с помощью центрифугирования (11400 XG, 15 мин), а также регулировать концентрацию наночастиц золота до 2 мкм.
- Добавить 4,1 МБк 125 I-меченый азида (1) в ДМСО (5 мкл) к суспензии наночастиц золота (4) (2 мкМ, 50 мкл).
- Выдержите полученной реакционной смеси при 40 & deg; С в течение 60 мин.
- Вывод аликвоту (0,2 мкл) из сырого продукта и применять его на кремнезем-COованные тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины.
- Разработка пластины тонкослойной хроматограммы, использу этилацетат в качестве подвижной фазы.
- Поместите пластину ТСХ на сканер радио-ТСХ и запустить сканер для контроля реакции радиоактивной (рисунок 3) в соответствии с протоколом производителя.
- После очистки сырого продукта
- Очищают реакционной смеси , содержащей 125 I-меченных наночастиц золота (4) путем центрифугирования (11400 XG, 15 мин).
- Слейте супернатант и добавить чистую воду для взмучивания золотых наночастиц гранул.
- Вывод аликвоту (0,2 мкл) из очищенного продукта и применять его на кремнеземную покрытием ТСХ пластины.
- Разработка пластины тонкослойной хроматограммы, использу этилацетат в качестве подвижной фазы.
- Поместите пластину ТСХ на сканер радио-ТСХ и запустить сканер для определения радиохимический выход и радиохимической чистоты 125 I-меченый голег наночастицы (4) (Рисунок 3) в соответствии с протоколом производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Реакция радиоиодирования из stannylated предшественника (2) проводили с использованием 150 МБк [125 I] NaI, уксусную кислоту, и хлорамин Т при комнатной температуре в течение 15 мин , чтобы обеспечить радиоактивно меченого продукта (1). После препаративной ВЭЖХ очистки сырой смеси целевой продукт был получен с 75 ± 10% (n = 8) радиохимический выход. Аналитическую ВЭЖХ показал , что радиохимической чистоты 125 I-меченого продукта было более чем на 99% (рисунок 2), а наблюдаемый удельная радиоактивность продукта 1 составляет 40,7 МБк / мкмоль. Твердофазной экстракции из фракции , содержащей очищенный продукт, используя картридж при условии , ацетон раствор 1. С помощью потока азота или газообразного аргона, органический растворитель может быть выпаривали, а затем остаток можно растворить снова в ДМСО или абсолютном этаноле в течение следующего STEп.
Для получения 125 I-мечения наночастиц золота полиэтилен-гликоль-модифицированный, то DBCO-группа-модифицированные наночастицы золота были получены по методике , показанной на рисунке 1. Избыточное количество полиэтиленгликоля тиола (MW 5000) с DBCO группами подвергали взаимодействию с цитратной, стабилизированные наночастицы золота 13 нм. После стадии модификации, продукт очищают путем последовательного центрифугирования с получением DBCO-функционализированные наночастицы золота (3). На стадии радиоактивной, 3,7 МБк 1 добавляли 2 мкМ 3 (~ 400 мкМ DBCO групп), и реакционную смесь мечение проводили при 40 ° С в течение 1 часа. Радио-ТСХ анализ показал , что более 95% от 1 подвергали взаимодействию с функциональными группами DBCO-группы-золотых наночастиц (3) в течение 60 мин. Реакцию проводили в течение 60 мин, а затем неочищенный продукт был PURманьяков с помощью центрифугирования. 125 I-меченый наночастицы золота (4) были получены с> 99% (n = 4) радиохимический выход , как определено по радио ТСХ (рисунок 3).
Рисунок 1. Radiosynthesis из 125 I-меченного азида (1) и 125 I-меченые наночастицы золота (4). Реагенты и условия: (а) [125 I] NaI, уксусная кислота, хлорамин Т, РТ, 15 мин, 75 ± 10% (N = 8) радиохимический выход; (Б) DBCO-ПЭГ-SH (MW 5000), H 2 O, RT, 2 ч; ~ 40 ° C, 60 мин,> 99% радиохимический выход. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
т = "Рисунок 2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54759 / 54759fig2.jpg" />
Рисунок 2. Аналитическая ВЭЖХ хроматограмму 125 I-меченый азида (1). (А) Radiochromatogram сырого продукта. (Б) Radiochromatogram очищенного продукта. (С) УФ - хроматограмма (254 нм) очищенного продукта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Результаты Радио-ТЛК 125 I-меченных наночастиц золота (4) (R F 4 = 0,05, R F 1 = 0,45, элюент: этилацетат) (а) после того, как реакции на 60 мин , и (б) после очистки./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В общем случае , наблюдаемая радиохимический выход очищенного 125 I-меченый азида (1) составляло 75 ± 10% (n = 8). Радиоактивной была выполнена с 50-150 МБк радиоактивности и радиохимического результаты вполне согласуются. Если [125 I] NaI (T 1/2 = 59,4 г) , который подвергся радиоактивному распаду в течение более одного месяца использовали в реакции радиоиодирования наблюдалось радиохимический выход 1 , чтобы быть незначительно снизилась (53-65%). Поэтому рекомендуется [125 I] NaI можно использовать , как только он производится или доставляется в лабораторию, чтобы получить оптимизированную радиохимический выход. Кроме того, свежеприготовленный хлорамин Т раствора, следует также использовать в реакции для получения желаемого радиохимический выход.
Поскольку предшественник (2) была достаточно гидрофобным, 150 мкл абсолютного этанола следует добавить , чтобы растворить 1 мг [125 I] NaI. Снижение растворимости предшественника часто приводит к низкой радиохимический выход 1. ДМСО также может быть использован для растворения 2 на стадии радиоактивной. Кроме того, уксусная кислота должна быть добавлена к раствору предшественника для получения высокой радиохимический выход на стадии радиоиодирования.
Перед использованием препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии для очистки сырого продукта , содержащего 1, то колонке с обращенной фазой ВЭЖХ должна быть вымыта с растворителями А и В (скорость потока: 10 мл / мин, элюент: градиент 100% растворител в течение 0-10 мин, 100 -0% растворител в течение 10-25 мин, и 0% растворителя в в течение 25-30 мин), чтобы удалить следовые количества примесей из системы. Затем колонке с обращенной фазой ВЭЖХ уравновешивали 20% растворител в 80% растворителя, в течение не менее 20 мин, чтобы получитьпоследовательное время удерживания 1.
Фракцию , содержащую очищенный 1 должна быть разбавлена более чем в 4 раза объем H 2 O в процедуре твердофазной экстракции. В противном случае, некоторые из очищенного продукта не могут быть захвачены в картридже tC18. Когда используют ацетон для элюирования очищенного 1 из картриджа, чтобы конечный объем может быть уменьшен за счет испарения ацетона с потоком азота или газообразного аргона при температуре окружающей среды.
Среди нескольких радиоактивных изотопов йода, 125 I был выбран и использован в текущем исследовании. Различные виды радиоизотопов йода должны быть проверены с использованием данного метода в других биологических и медицинских исследований (например, 124 I для работы с изображениями ПЭТ, 131 I для терапевтических целей).
Насколько мы понимаем, настоящий радиоактивной протокол представляет собой первый доклад, описывающий подробную synthetiC шаги по радиоактивным йодом-меченых азида группы. Недавно мы опубликовали еще одну азида простетическую группу, которая имеет другую структуру 23. Тем не менее, радиоактивно азид (1) в текущем методе при условии , немного лучше радиохимических результаты , чем другие с точки зрения радиоактивной эффективности с DBCO-групп , содержащих молекулы. Существующие протезно группы (т.е. N -hydroxysuccinimide и малеимида) для маркировки радиоактивного йода не может обеспечить сайт-специфичность. Тем не менее, данный способ демонстрирует эффективность простой радиоактивной наряду с прекрасными bioorthogonality. Поскольку функциональная группа азид , как известно, обладают высокой устойчивостью в физиологических условиях и в условиях естественных условиях, радиоактивно меченный продукт (1) может быть использован в предварительно целевых исследованиях в естественных изображений. Мы ожидаем , что этот метод будет эффективно применяется как в пробирке и в естественных условиях йодного радиоизотопа LAbeling биомолекул и наноматериалов, которые содержат натянутые структуру cyclooctyne.
На основании удельной радиоактивности 1, рассчитанное мольное отношение 125 наночастиц I и золота ~ 1: 1 . 125 I-меченые наночастицы золота (4) могут быть использованы в визуализации и биораспределению исследований молекулярных наноматериалов. Текущий метод может быть также применен к радиоактивное мечение йодом различных размеров и форм золотых наноматериалы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
[125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
Formic acid | Sigma | 251364 | |
Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Acetone | Sigma | 650501 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | |
DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
- Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
- Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
- Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
- Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
- Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
- Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
- Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
- Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
- Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
- Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
- Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
- Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
- Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
- Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
- Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
- Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
- Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
- Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
- Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).