De algemene doelstelling van dit protocol is om nauwkeurig af te stemmen magnetic resonance imaging (MRI) image volumes met histologie secties via de creatie van op maat gemaakte 3D geprint hersenen houders en snijmachine dozen.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
De hier geschetste protocol maakt een nauwkeurige vergelijking van MRI en histologie secties. Het protocol wordt in een standaard formaat dat kan worden toegepast op hersenen van mensen en kleine dieren, zoals knaagdieren of zijdeaapjes. Verschillen die specifiek zijn voor grote (menselijke) en kleine (niet-menselijke primaten en knaagdieren) hersenen zijn gemarkeerd en in de bijgaande video en cijfers tonen we de toepassing in de marmoset. De invalshoek is eenvoudig, de werkwijze vereist vele stappen en het gebruik van verschillende soorten software. Bovendien verschillende problemen mogelijk waardoor de nauwkeurigheid van deze methode is belangrijk te vermelden.
De beeldkwaliteit van de in vivo MRI is een belangrijke factor. Om het verschil in beeldresolutie tussen MRI en histologie gedigitaliseerde beelden te minimaliseren, moet de kleinst mogelijke MRI voxel grootte worden gebruikt. Deze definitie geldt ook voor de beeldkwaliteit van de postmortale MRI. Door de grotereacquisitie tijd in postmortem MRI maakt het mogelijk veel hogere beeldresolutie, de voorbereiding kan het artefacten te introduceren zoals focale signaal dropouts in verband met luchtbellen. Deze artefacten kunnen gebieden van het weefsel verhullen en beïnvloeden de contour. Bovendien, de afmetingen van het weefsel op de postmortale MRI waarschijnlijk worden beïnvloed door het fixatieproces en duur. Terwijl de in vivo ex vivo MRI vrijwel overeenkomen kan worden benaderd door gebruik anatomische oriëntatiepunten in slice geometrie opstart tijdens acquisitie zou een niet-lineaire registratie nog steeds nodig zijn om een hogere nauwkeurigheid bereikt in de aanpassing van deze twee MRI beelden.
Het ontwerp van de hersenen houder en snijmachine is een cruciale stap. Bij het creëren van het digitale model van de hersenen, is een egalisatie algoritme toegepast die enigszins vergroot het model opzichte van de vaste hersenen. Dit maakt gemakkelijk inbrengen van de hersenen in de houder en snijmachine en vermindert de scherpe randen in de houder &# 39; s contour. Indien het model te groot is (bijvoorbeeld meer dan 5%), de hersenen kan bewegen tijdens de postmortem MRI en / of snijden. Een ander belangrijk punt is het ontwerp van de hersenen model aan te passen dat het cerebellum goed in de 3D geprint object geplaatst. Dit kan vooral lastig zijn wanneer de kleine hersenen heeft tijdens de hersenen extractie bij de autopsie is beschadigd.
Bij het afdrukken van de hersenen snijmachine en houder, het type 3D printer moet ook zorgvuldig worden gekozen. Sommige multi-jet printers vereisen post-processing met behulp van een oven om steun materiaal te verwijderen. Hoewel deze printers objecten die waterdicht en relatief duurzamer dan desktop Fused Deposition Modeling (FDM) printers kan produceren, het verwarmingsproces aan steunen te verwijderen kan enigszins vervormen geven, creëren blade gaten die niet perfect loodrecht op de hersenen contour.
De hersenen snijden proces is een cruciale stap. Voor het snijden the gehele hersenen tot platen, is het belangrijk ervoor te zorgen dat de hersenen vast zit in de hersenen slicer er mag geen beweging wanneer lichte druk wordt aangebracht op de hersenen. Dit maakt het mogelijk dat de messen door de hersenen te snijden op de precieze locatie van de onderzoekers vastgesteld. Een continue, evenwichtige druk moet worden aangebracht op beide meshouders bij het zagen. Afhankelijk van de scherpte van de bladen en de stijfheid van het weefsel, kan een lichte dwarse snijbeweging voordelig voor handhaving platte snijvlakken zijn.
De paraffine inbedding proces kan ook een bron van verkeerde uitlijning tussen MRI en histologie worden. Als het weefsel niet vlak plaat zit tegen de cassette tijdens het inbedden, zal er een kanteling tussen het snijvlak van het microtoom en het oppervlak plaats van de plaat zijn. Dit vereist snijden onbruikbare gedeelten om een plat vlak waarbij alle weefsel wordt blootgesteld voorbeeld. Een manier om te corrigeren voor de kantelingwordt door de hoek van het zichtbare vlak op de hoge-isotrope resolutie postmortem MRI. Dit is echter vrijwel onmogelijk kan worden uitgevoerd op de in vivo MRI die meestal wordt verkregen met anisotrope resolutie (meestal dikke coronale plakken).
Ten slotte kan het weefsel enkele vervorming tijdens de formaline fixatie periode en inbedden in paraffine (krimp) ervaren, evenals tijdens de voorbereiding van dia's (vouwen, scheuren, rimpels). Sommige van deze vervormingen kunnen worden gecorrigeerd door er 4-5 urn secties in een waterbad vóór de overbrenging op objectglaasjes. Andere vervormingen kan deels worden opgelost door het uitvoeren van vervormbare beeld coregistratie van de histologische gedigitaliseerde beelden naar de postmortale MRI-beelden. Niettemin minimaliseren van de vervormingen zorgvuldige en bekwame praktijk de meest effectieve aanpak overeenkomende MRI volumes secties histologie.
Tot slot, de hier geïntroduceerde methode maakt investigators om nauwkeurig te beoordelen van de onderliggende pathologie van MRI bevindingen. Meer in het algemeen is een veelbelovende benadering voor het identificeren en / of valideren van nieuwe biomerkers voor MRI onderzoeken die specifieke pathologische processen, zoals ontsteking of remyelinisatie targeten.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |