המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא ליישר הדמיה בתהודה מגנטית במדויק כרכי תמונה (MRI) עם קטעים היסטולוגיה באמצעות יצירת בעלי המוח 3D מודפס אישית ותיבות מבצעה.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר השוואה מדויקת בין MRI וחתכים היסטולוגיה. הפרוטוקול מוצג במתכונת אחידה כי ניתן להחיל על מוחם של בני אדם או בעלי חיים קטנים, כגון מרמוסטים או מכרסמים. הבדלים ספציפיים גדול (אדם) וקטנים (פרימטים לא אנושיים ו מכרסם) מוח מודגש, ובסרטון ודמויות המצורפים אנחנו מדגימים את היישום המרמוסט. למרות הגישה היא פשוטה, השיטה דורשת צעדים רבים, כמו גם את השימוש כמה סוגים של תוכנה. יתר על כן, מספר בעיות שעלולים להשפיע על הדיוק של שיטה זו הן חשובות להזכיר.
איכות התמונה של MRI in vivo היא גורם חשוב. כדי למזער את הפער רזולוציית תמונה בין MRI ותמונות היסטולוגיה דיגיטליות, גודל voxel MRI הקטן ביותר האפשרי אמור לשמש. מושג זה חל גם על איכות התמונה של ה- MRI לאחר המוות. בעוד גדלרכישת הזמן ב- MRI לאחר המוות מאפשר רזולוציית תמונה גבוהה בהרבה, ההכנה יכולה להציג ממצאי תמונה כגון נשירת אות מוקדים הקשורים בועות אוויר. ממצאים אלה יכולים לטשטש אזורים של רקמות וכן להשפיע קונטור שלה. יתר על כן, את הממדים של הרקמה על MRI לאחר המוות צפויים להיות מושפעים על ידי תהליך קיבוע ומשך. בעוד in vivo כדי משחק vivo לשעבר MRI יכול להיות מקורב מקרוב על ידי ניצול ציוני דרך אנטומיים בהגדרת גיאומטריה פרוסה במהלך הרכישה נעשה רישום שאינו ליניארי עדיין יהיה צורך להגיע רמה גבוהה יותר של דיוק בהתאמת שתי התמונות האלה MRI.
העיצוב של בעל מוח מבצעה הוא גם צעד מכריע. ביצירת המודל הדיגיטלי של המוח, אלגוריתם החלקה מוחל שמביאה להגדלה ביחס המודל מעט למוח הקבוע. זה מאפשר החדרה קלה של המוח לתוך המחזק שלו ואת מבצעה ומפחית קצוות חדים במחזיק &# 39; קונטור s. עם זאת, אם המודל הוא גדול מדי (למשל, על ידי יותר מ -5%), המוח יכול לזוז במהלך MRI לאחר המוות ו / או החתך. נקודה חשובה נוספת היא להתאים את העיצוב של דגם המוח כך המוח הקטן ממוקם כראוי בתוך האובייקט מודפס 3D. זה יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר המוח הקטן נפגע במהלך חילוץ מוח הנתיחה.
בעת הדפסת מבצעה במוח בעל, את סוג מדפסת 3D חייב גם להיות שנבחר בקפידה. חלק מדפסות רב-סילון דורשים שלאחר עיבוד באמצעות תנור להסיר חומר תמיכה. בעוד מדפסות אלה יכולים לייצר אובייקטים למים יחסית עמיד יותר ממדפסות דוגמנות בתצהיר התמזגו שולחן העבודה (FDM), תהליך החימום להסיר תומך לשבש את הקופסה מילימטרים ספורים, יצירת פערים להב שאינם ניצבים באופן מושלם את חיטובי המוח.
תהליך חתך המוח הוא עוד צעד חיוני. לפני חיתוך המוח הדואר כולו לתוך לוחות, חשוב לוודא כי המוח יושב בחוזקה בתוך מבצעה במוח: לא אמור להיות תנועה כאשר לחצו קל מוחל על המוח. זה יעשה את זה אפשרי עבור הלהבים לחתוך דרך המוח נכחה בזירה שקבע החוקרים. לחץ רצוף, מאוזן צריך להיות מוחל על שני בעלי הלהב בעת חיתוך. בהתאם החד של הלהבים הנוקש של הרקמות, בתנועות חיתוך רוחביות קלות יכולות להיות יתרון עבור שמירת משטחי חתך שטוחים.
תהליך ההטבעה-פרפין יכול להיות גם מקור של חוסר תיאום בין MRI ו היסטולוגיה. אם לוח הרקמות אינו יושב שטוחים על הקלטת בתהליך ההטבעה, תהיה הטיה בין מטוס החיתוך של microtome ומקום השטח של הלוח. זה ידרוש קיצוץ בסעיפים שמישים למצוא מישור שטוח שבו כל הרקמה חשופה. דרך אחת לתקן את ההטיההיא על ידי שינוי הזווית של המטוס לצפייה MRI לאחר המוות גבוהה איזוטרופיים ברזולוציה. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לבצע על MRI vivo ב כי היא רכשה בדרך כלל עם רזולוצית איזוטרופי (בדרך כלל פרוסות העטרה עבות).
לבסוף, הרקמה יכולה לחוות כמה עיוות במהלך תקופת הקיבוע בפורמלין והטבעת פרפין (הצטמקות), כמו גם במהלך תקופת ההכנה של שקופיות (מתקפלים, פיצוח, קמטים). חלק דפורמציות אלה ניתן לתקן על ידי צבת 4-5 מיקרומטר החלקים באמבט מים לפני ההעברה על גבי שקופיות. ניתן דפורמציות אחרים נפתרה חלקית על ידי ביצוע coregistration תמונה ובר-עיוות של תמונות דיגיטציה היסטולוגית לתמונות MRI לאחר המוות. אף על פי כן, מזעור דפורמציות עם תרגול זהיר ומיומן היא הגישה היעילה ביותר כדי התאמת כמויות MRI כדי היסטולוגיה סעיפים.
לסיכום, המתודולוגיה הציג כאן מאפשר investigators להעריך את הפתולוגיה הבסיסית במדויק ממצאי ה- MRI. באופן כללי יותר, היא גישה מבטיחה לזיהוי ו / או על מנת לאשר ביומרקרים MRI רומן ללימודי מחקר למקד תהליכים פתולוגיים ספציפיים, כגון דלקת או מיאלין מחדש.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |