El objetivo general de este protocolo es para alinear con precisión los volúmenes de imágenes magnéticas resonancia nuclear (RMN) con secciones histológicas a través de la creación de los titulares del cerebro en 3D impresos personalizados y cajas de la máquina de cortar.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
El protocolo descrito aquí permite una comparación exacta entre la RM y secciones histológicas. El protocolo se presenta en un formato unificado que se puede aplicar a los cerebros de seres humanos o animales pequeños, tales como monos tití o roedores. Las diferencias específicas a grande (humana) y pequeñas (de primates no humanos y roedores) cerebros se ponen de relieve, y en el video y las figuras adjuntas que muestran la aplicación en el tití. Aunque el enfoque es sencillo, el método requiere muchos pasos, así como el uso de varios tipos de software. Por otra parte, hay varias cuestiones que puedan afectar a la exactitud de este método son importantes de mencionar.
La calidad de imagen de la resonancia magnética in vivo es un factor importante. Para minimizar la disparidad en la resolución de la imagen entre la RM y la histología imágenes digitalizadas, el tamaño de resonancia magnética voxel más pequeño posible se debe utilizar. Este concepto se aplica también a la calidad de imagen de la MRI postmortem. Mientras que el aumento de latiempo de adquisición en MRI postmortem permite mucho más alta resolución de la imagen, la preparación puede introducir artefactos de imagen tales como pérdidas de señal de coordinación relacionados con las burbujas de aire. Estos artefactos pueden ocultar áreas del tejido, así como afectar a su contorno. Por otra parte, las dimensiones del tejido en la autopsia MRI son propensos a ser afectados por el proceso de fijación y duración. Mientras que la in vivo para ex vivo partido de resonancia magnética se puede aproximar estrechamente mediante la utilización de puntos de referencia anatómicos en la configuración de la geometría rebanada durante la adquisición, el registro no lineal todavía sería necesario alcanzar un mayor grado de precisión en la adecuación de esas dos imágenes de resonancia magnética.
El diseño del soporte de la máquina de cortar cerebro y es también un paso crucial. En la creación del modelo digital del cerebro, se aplica un algoritmo de suavizado que agranda ligeramente el modelo en relación con el cerebro fijo. Esto permite una fácil inserción del cerebro en su soporte y la máquina de cortar y reduce los bordes afilados en el soporte y# 39; s contorno. Sin embargo, si el modelo es demasiado grande (por ejemplo, en más de un 5%), el cerebro podría moverse durante el postmortem MRI y / o el seccionamiento. Otro punto importante es adaptar el diseño del modelo de cerebro, de modo que el cerebelo está correctamente colocado en el interior del objeto 3D impreso. Esto puede ser particularmente difícil cuando el cerebelo ha sido dañado durante la extracción del cerebro en la autopsia.
Cuando la impresión de la máquina de cortar el cerebro y el soporte, del tipo de impresora 3D también deben ser elegidos cuidadosamente. Algunas impresoras de chorro múltiple requieren post-procesado utilizando un horno para eliminar el material de soporte. Si bien estas impresoras pueden producir objetos que son a prueba de agua y relativamente más duradero que las impresoras de escritorio fusionado modelado por deposición (FDM), el proceso de calentamiento para eliminar soportes pueden deformar ligeramente la caja, la creación de lagunas de cuchilla que no son perfectamente perpendicular al contorno cerebro.
El proceso cerebral de seccionamiento es otro paso crucial. Antes de cortar THe de todo el cerebro en losas, es importante asegurarse de que el cerebro está sentado firmemente dentro de la máquina de cortar de cerebro: no debe haber movimiento cuando se aplica una ligera presión en el cerebro. Esto hará posible que las cuchillas corten a través del cerebro en el lugar preciso establecido por los investigadores. Una presión continua, equilibrada debe aplicarse a ambos soportes de cuchilla durante el corte. Dependiendo del filo de las cuchillas y la rigidez del tejido, un ligero movimiento de corte transversal podría ser ventajoso para el mantenimiento de superficies de corte planas.
El proceso de inclusión en parafina también puede ser una fuente de falta de alineación entre la resonancia magnética y la histología. Si la losa tejido no está sentado plana contra la casete durante el proceso de incrustación, habrá una inclinación entre el plano de corte de la micrótomo y el lugar superficie de la losa. Esto requerirá cortar secciones inutilizables para encontrar una superficie plana en la que está expuesta todo el tejido. Una manera de corregir la inclinaciónes cambiando el ángulo del plano de visualización en el MRI postmortem de alta isotrópico-resolución. Sin embargo, esto es casi imposible de realizar en el vivo MRI en que por lo general se adquiere con la resolución anisotrópico (típicamente gruesas rebanadas coronales).
Finalmente, el tejido puede experimentar una cierta deformación durante el período de la fijación con formalina y la incrustación de parafina (contracción), así como durante la preparación de diapositivas (plegable, grietas, arrugas). Algunas de estas deformaciones se pueden corregir poniendo las secciones 4-5 micras en un baño de agua antes de ser transferido en portaobjetos. Otros deformaciones se pueden resolver parcialmente mediante la realización de coregistration imagen deformable de las imágenes digitalizadas histológicos a las imágenes de resonancia magnética post mortem. Sin embargo, lo que minimiza las deformaciones con la práctica cuidadosa y hábil es el método más eficaz de igualar los volúmenes de resonancia magnética a la histología secciones.
En conclusión, la metodología presentada aquí permite investigators para evaluar con precisión la patología subyacente de los resultados de la RM. Más en general, es un enfoque prometedor para identificar y / o validar nuevos biomarcadores de resonancia magnética para estudios de investigación que se dirigen a procesos patológicos específicos, tales como la inflamación o la remielinización.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |