3D Baskı Teknolojisini kullanan Histoloji ile MRG Birleştirme: Beyin için Protokol Kesit
Summary
Bu protokolün genel amacı doğru özelleştirilmiş 3D baskılı beyin sahipleri ve dilimleme kutuları oluşturulması yoluyla histoloji bölümleri ile manyetik rezonans görüntüleme (MRG) görüntü hacimleri hizalamak.
Abstract
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
Introduction
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada özetlenen protokol MRG ve histoloji bölümleri arasında doğru bir karşılaştırma sağlar. protokol, marmosetler ve kemirgenler olarak insanlara veya küçük hayvanların beyinlerinde uygulanabilir birleşik biçiminde sunulmaktadır. büyük (insan) özgü ve beyinleri vurgulanır (insan dışı primat ve kemirgen), küçük ve beraberindeki video ve şekillerde farklılıklar biz marmoset uygulamayı göstermektedir. yaklaşım, basit olmasına rağmen, bu yöntem birçok adım hem de yazılımın çeşitli türleri kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, potansiyel olarak bu yöntemin doğruluğunu etkileyen çeşitli sorunlar söz önemlidir.
In vivo MR görüntü kalitesi önemli bir faktördür. MRG ve dijitalleşen histoloji görüntüleri arasında görüntü çözünürlüğünde eşitsizliği en aza indirmek için, mümkün olan en küçük MR voksel boyutu kullanılmalıdır. Bu kavram aynı zamanda postmortem MR görüntü kalitesi için de geçerlidir. artarkenpostmortem MRG kazanım süresi hazırlık böyle hava kabarcıkları ile ilgili odak sinyal terkinde gibi görüntü eserler tanıtabilirsiniz, çok daha yüksek görüntü çözünürlüğü sağlar. Bu eserler dokusunu belirsiz yanı sıra konturu etkileyebilir. Dahası, postmortem MR doku boyutları tespit süreci ve süresine göre etkilenme olasılığı vardır. In vivo, ex vivo MR maçı yakından edinimi sırasında dilim geometri kurulumunda anatomik yerlerinden kullanarak yaklasık edilebilir olsa da, doğrusal olmayan bir kayıt hala bu iki MR görüntüleri eşleşen bir doğruluk yüksek derecede ulaşmak için gerekli olacaktır.
Beyin tutucu ve dilimleme makinesi tasarımı da çok önemli bir adımdır. Beynin dijital model yaratırken, bir yumuşatma algoritması biraz sabit beyne modeli göreceli büyütür olduğu uygulanır. Bu, tutucu ve dilimleme makinesi içine beynin kolay takılmasını sağlar ve tutucu keskin kenarları azaltır ve# 39; ın kontur. Model çok büyükse Ancak, (örneğin, daha fazla% 5), beyin postmortem MR ve / veya kesit sırasında hareket edebilir. Bir diğer önemli nokta Beyincik düzgün 3D baskılı nesnenin içine yerleştirilir ve böylece beyin modelinin tasarımını adapte etmektir. Beyincik otopside beyin çekimi sırasında zarar görmüşse, bu özellikle zor olabilir.
Beyin dilimleme makinesi ve tutucu yazdırırken, 3D yazıcı türü de dikkatle seçilmelidir. Bazı çoklu püskürtmeli yazıcılar destek malzemesi çıkarmak için bir fırın kullanarak post-processing gerektirir. bu yazıcıların su geçirmez ve masaüstü erimiş birikim modelleme (FDM) yazıcılara göre nispeten daha dayanıklı nesneleri üretmek mümkün olmakla birlikte, ısıtma işlemi beyin kontur mükemmel dik olmayan bıçak boşlukları oluşturarak, biraz kutuyu çözgü destekleri kaldırın.
Beyin kesit işlemi başka önemli bir adımdır. th kesme öncee levhalar halinde tüm beyin, beyin, beyin dilimleme makinesi içinde sıkıca oturuyor emin olmak için önemlidir: hafif basınç beynin üzerine tatbik edilir hiçbir hareket olmamalıdır. Bu mümkün bıçakları araştırmacılar tarafından belirlenen kesin bir yerde beyin aracılığıyla kesmek için yapacaktır. keserken sürekli, dengeli basınç hem bıçak sahiplerine uygulanmalıdır. Bıçakların netlik ve doku sertliğine bağlı olarak, hafif çapraz kesim hareketi düz kesim yüzeylerini korumak için avantajlı olabilir.
parafin gömme işlemi de MRG ve histoloji arasındaki hiza bir kaynak olabilir. Doku levha gömme işlemi sırasında kaset karşı düz oturan değilse, microtome kesme düzleminin ve levhanın yüzey yeri arasında bir eğim olacak. Bu, tüm doku maruz kaldığı düz uçağı bulmak için kullanılamaz bölümleri kesme gerektirecektir. eğilmelerini düzeltmek için bir yolduryüksek izotropik çözünürlüklü postmortem MR görüntüleme düzlemin açısını değiştirerek gereğidir. Ancak, bu genellikle anizotropik çözünürlük (genellikle kalın koronal dilim) ile kazanılır in vivo MR gerçekleştirmek neredeyse imkansızdır.
Son olarak, doku, yanı sıra (kırışıklık, çatlama, katlama) slaytlar hazırlanması sırasında formalin sabitleme dönemi ve parafine (büzülme) sırasında bazı deformasyon yaşayabilirsiniz. Bu deformasyonlar bazıları Slaytlarınıza aktarmadan önce bir su banyosunda 4-5 mikron bölümleri koyarak düzeltilebilir. Diğer deformasyonlar kısmen postmortem MR görüntüleri histolojik dijital görüntülerin deforme olabilen görüntü coregistration yaparak çözülebilir. Bununla birlikte, dikkatli ve yetenekli uygulama ile deformasyonları en aza bölümleri histoloji için MRG hacimleri eşleşen en etkili yaklaşımdır.
Sonuç olarak, burada sunulan metodoloji inv sağlarestigators doğru MRG bulguları altta yatan patolojiyi değerlendirmek için. Daha genel olarak, tanımlanması ve / veya iltihap veya remiyelinizasyon gibi belirli patolojik süreçler, hedef araştırmalar için yeni MR biyobelirteçlerini doğrulamak için umut verici bir yaklaşımdır.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
Materials
| 7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
| 38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
| Fomblin | Solvay Solexis | ||
| 50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
| Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
| Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
| Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
| Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
| ETOH | |||
| Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
| .75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
| Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
| Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
| Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
| Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
| Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
| Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software | |
Riferimenti
- Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
- ‘t Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
- Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
- Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
- Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
- Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
- McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
- Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
- Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
- Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
- Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).
