अलगाव और कुत्ते धमनियों और नसों से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की संस्कृति
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
कुत्तों हृदय रोग अनुसंधान के लिए बड़े जानवर मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और यह भी सहज (जेनेटिक) संवहनी असामान्यताएं 1, 2 से ग्रस्त कर सकते हैं। इन रोगों वाणिज्यिक endothelial सेल लाइनों अक्सर endothelial सेल (ईसी) की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं अध्ययन करने के लिए। कुत्तों के लिए वहाँ एक वाणिज्यिक endothelial सेल लाइन उपलब्ध है (CnAOEC), कुत्ते महाधमनी से प्राप्त होता है। यह सेल लाइन ज्यादातर के रूप में नियंत्रण सामान्य ईसीएस 3-5 अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। मानव हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया endothelial सेल लाइनों मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) और मानव नाल धमनी endothelial कोशिकाओं (HUAECs) मानव गर्भनाल शिरा और धमनी, क्रमशः से निकाली गई है। HUVECs 1980 के दशक के बाद से 6 संवहनी अनुसंधान के क्षेत्र में स्वर्ण मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया है। वे endothelial समारोह और रोग अनुकूलन अध्ययन करने के लिए क्लासिक मॉडल प्रणाली माना जाता है। विभिन्न रक्त वाहिकाओं से अलग endothelial कोशिकाओं appearanc में भिन्नताई और आनुवंशिक पृष्ठभूमि और microenvironment 7 के लिए जोखिम के कारण कार्यक्षमता। इसके अलावा, HUVECs और HUAECs, गर्भनाल से प्राप्त कर रहे हैं एक विकासात्मक संवहनी संरचना है कि शर्तों के संबंध में पूरी तरह से नकल वयस्क रक्त वाहिकाओं वे करने के लिए और रोग के जवाब सामने आ रहे हैं नहीं हो सकता है। इसलिए, सामान्य रूप में हृदय रोग के लिए HUVECs में पाया परिणाम और HUAECs अनुवाद अपर्याप्त है।
जब अनुकूलन और वयस्क ईसीएस के व्यवहार का अध्ययन, ब्याज की पोत से प्राथमिक ईसीएस एक और अधिक प्रत्यक्ष दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए, कई तरीकों की जानकारी मिली है। एक व्यापक रूप से वर्णित विधि है, जो भी HUVECs के लिए प्रयोग किया जाता है, एक enzymatic पाचन समाधान 8 के साथ पोत निस्तब्धता है। इस बार इस तरह की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और fibroblasts 9 के रूप में गैर-ईसीएस के साथ संदूषण में परिणाम है। अलगाव के लिए एक और अक्सर इस्तेमाल किया विधि कीमा पोत ऊतक के enzymatic पाचन fluorescence- द्वारा पीछा किया हैसक्रिय सेल छँटाई (FACS) और भेदभाव (सीडी) 31 7, 8। FACS छँटाई के endothelial सेल मार्कर क्लस्टर बाद सेल संस्कृति के आधार पर कोशिकाओं की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की आवश्यकता है और इसलिए छोटे रक्त वाहिकाओं से endothelium के अलगाव के लिए उपयुक्त नहीं है। इसलिए हम उच्च शुद्धता के साथ विभिन्न कुत्ते रक्त वाहिकाओं से एक शुद्ध endothelial सेल आबादी को अलग-थलग करने के लिए एक नया मजबूत विधि को विकसित करने के उद्देश्य से। नई अलगाव विधि की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, हम अलग अलग और कुत्ते धमनियों और नसों, दोनों बड़े और छोटे से शुद्ध कुत्ते प्राथमिक Endothelial सेल (CaPEC) संस्कृतियों प्राप्त की। इस विधि को भी इस तरह के सहज अंतर या अतिरिक्त यकृत portosystemic शंट, कुत्तों 2 में एक आम बीमारी के रूप में रोगग्रस्त और / या न्यायपालिका जहाजों से होने वाले endothelial कोशिकाओं की संस्कृति सक्षम बनाता है। पोत के बाद से सबसे int रहता विधि ऐसे संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में ही पोत के अतिरिक्त प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता हैप्रक्रिया के दौरान काम करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कुत्ते ईसीएस पर ध्यान केंद्रित अध्ययन में CnAOEC प्राथमिक लाइन कुत्ता 3, 12, 13 के endothelial प्रजातियों मॉडल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। मानव अध्ययन में, HUVEC संस्कृति अभी भी सोने के मानक माना जाता है। जाहिर ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
Riferimenti
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