Préparation de rAAV9 à surexpriment ou Knockdown gènes dans les coeurs de souris
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Contrôle de l'expression ou l'activité de gènes spécifiques grâce à la prestation myocardique du matériel génétique dans des modèles murins permet l'étude des fonctions des gènes. Leur potentiel thérapeutique dans le coeur peut également être déterminée. Il existe des approches limitées d'intervention moléculaire in vivo dans le coeur de la souris. Recombinant virus adéno-associé (rAAV) à base de l' ingénierie des génomes a été utilisé comme un outil essentiel pour la manipulation génétique cardiaque in vivo. Les avantages spécifiques de cette technologie incluent une grande efficacité, une spécificité élevée, le faible taux d'intégration génomique, minimal l'immunogénicité et le pouvoir pathogène minimal. Ici, une procédure détaillée pour construire, ensemble, et purifier les vecteurs rAAV9 est décrit. l'injection sous-cutanée de rAAV9 dans les petits nouveau-nés se traduit par une expression robuste ou knock-down efficace du gène (s) d'intérêt dans le cœur de souris, mais pas dans le foie et d'autres tissus. Utilisation de la spécifi cardiaquec promoteur TnnT2, une expression élevée du gène de la GFP dans le coeur a été obtenu. En outre, la cible de l'ARNm a été inhibée dans le coeur quand un rAAV9-U6-shRNA a été utilisé. la connaissance de la technologie rAAV9 travail peut être utile pour les enquêtes cardiovasculaires.
Introduction
Contrôle de l' expression ou l' activité de gènes spécifiques dans divers systèmes biologiques est devenue une stratégie intéressante pour l'étude de la fonction du gène 1. Un moyen direct d'atteindre cet objectif consiste à manipuler des séquences de nucléotides et de générer des alleles mutants. Bien que la fabrication précises, des changements ciblés dans le génome des cellules vivantes est encore un temps et la pratique de main-d'œuvre, le développement des outils Talen et CRISPR / cas9 puissants a ouvert une nouvelle ère de l' édition du génome 2-5. Une méthode de laboratoire plus de routine pour la manipulation génétique a mis l' accent sur l'introduction de matériaux génétiques (ADN et ARN contenant des séquences codantes ou siRNA / shRNA) dans les cellules pour exprimer ou knockdown gène (s) d'intérêt 1,6.
Dans de nombreux cas, le principal goulot d'étranglement pour la manipulation génétique est la délivrance d'ADN, d'ARN ou de protéine dans les cellules. En ce qui concerne les études in vitro, l' efficacité transfectisur les systèmes ont été mis en place dans de nombreuses lignées cellulaires cultivées. Cependant, dans le modèle de souris , en particulier, l' administration in vivo de gènes est plus difficile. Il existe une série de barrières extra- et intracellulaires qui doivent être court-circuité afin d'obtenir une absorption cellulaire efficace des réactifs exogènes. Obstacles supplémentaires comprennent le jeu rapide et la courte durée de la matériaux 7,8 livrés. Une stratégie pour contourner ces problèmes est d'utiliser des vecteurs viraux comme «porteurs» ou «véhicules» pour la livraison de gènes in vivo. Les propriétés de transduction naturellement évolué de virus permettent la prestation efficace d'un gène d'intérêt dans les cellules 7,9,10. De nombreux types de vecteurs viraux ont été développés et permettent flexible dans la manipulation génétique in vivo dans des types et des organes différents de cellules chez la souris.
Les systèmes viraux les plus couramment utilisés comprennent Rétrovirus, lentivirus, adénovirus et virus adéno-associé (AAV) <sup> 11. Les retrovirus sont des virus à ARN simple brin et peuvent introduire leur matériel génétique dans le génome de la cellule hôte de manière stable au cours de la mitose, en fournissant le potentiel d'expression des gènes tout au long transduits dans les cellules et les organes cibles 12-14. Cependant, de nombreux types de retrovirus seulement infectent les cellules en division, et leur efficacité dans les cellules non en division 15 est très faible. Cela limite leur utilité pour la délivrance de gènes. Lentivirus est un genre de la famille des Retroviridae. Différent des autres retrovirus, lentivirus peut infecter les cellules en division et ne se divisant pas et a été largement utilisé pour le transfert de gènes dans des post-mitotiques et des cellules hautement différenciées 16. Le cycle de vie de lentivirus implique également l'intégration de l'ADN du vecteur dans le génome hôte. Ainsi , la délivrance de gènes, médié par lentivirus permet une expression stable et de longue durée des éléments génétiques transduites 16-18. Toutefois, cette fonctionnalité peut représenter une double-eépée DGED dans l'utilisation de ces virus pour manipuler l'expression génique, comme l'intégration de l'ADN du vecteur peut conduire à la mutagenèse insertionnelle dans les cellules hôtes et peut provoquer des effets artefactuelles. Adénovirus est un autre système de délivrance de gènes largement utilisé. Contrairement à retrovirus et lentivirus, adénovirus sont non-intégrés et ne pas interférer avec l'intégrité génomique des cellules hôtes 8,10,11,19. En outre, les adenovirus peut transfecter l' ADN dans de nombreux types cellulaires, et l' infection ne dépend pas de la division cellulaire active 19. Une autre caractéristique importante de adenovirus est la facilité de purification des vecteurs, comme les vecteurs viraux sont capables de répliquer 19,20. Toutefois, la mise en garde importante de ce système est que l' infection par adenovirus peut déclencher de fortes réponses immunitaires dans des cellules et des organes cibles de 19, ce qui limite son utilisation dans de nombreuses recherches, notamment dans les études de thérapie génique.
Par rapport à ces différents typess des vecteurs viraux, le virus adéno-associé recombinant (rAAV) semble être le système de délivrance de gènes idéal 21,22. Il présente une immunogénicité minimale et 23,24 pathogénicité. En outre, le rAAV infecte une large gamme de types de cellules, y compris à la fois de division et des cellules non en division. Dans la plupart des cas, rAAV ne pas intégrer dans les génomes d'accueil; ainsi, le risque de changements génétiques ou génomiques indésirables dans les cellules cibles est faible 22.
Récemment, les systèmes de rAAV ont été utilisés avec succès pour la fourniture de protéines de l'ADN codant, miARN, shRNA et CRISPR-ARNg in vivo dans le muscle cardiaque souris 23,25-29. Cette méthodologie a permis recherches fondamentales et les études de thérapie génique dans le domaine de la recherche cardiovasculaire. Ici, la procédure détaillée pour générer des vecteurs rAAV9 qui surexpriment ou knockdown les gènes d'intérêt dans les cœurs de souris a été décrit de manière efficace. Le protocole fournit une méthode simple et efficace dela manipulation de l'expression du gène cardiaque dans des modèles expérimentaux murins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est important de réduire au minimum la recombinaison indésirable ITR lors de la construction du plasmide. Avant de générer le virus, il faut toujours surveiller l'intégrité ITR des plasmides AAV en utilisant une digestion de restriction et électrophorèse sur gel d'agarose. Il est impossible d'obtenir 100% des plasmides intacts, mais le taux de recombinaison doit être minimisée autant que possible. Moins de 20% est acceptable pour le succès de l'emballage rAAV9. À noter, la culture des bact…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
Riferimenti
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