Preparazione di rAAV9 per iperespressione o Knockdown geni in Cuori mouse
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Controllare l'espressione o l'attività di specifici geni attraverso la consegna del miocardio del materiale genetico in modelli murini permette l'indagine delle funzioni dei geni. Il loro potenziale terapeutico nel cuore può anche essere determinato. Ci sono approcci limitati di intervento molecolare in vivo nel cuore del mouse. Ricombinante virus adeno-associato (rAAV) ingegneria del genoma basata su è stata utilizzata come uno strumento essenziale per in vivo manipolazione genetica cardiaco. I vantaggi specifici di questa tecnologia sono ad alta efficienza, alta specificità, basso tasso di integrazione genomica, minimal immunogenicità e patogenicità minima. Qui, una procedura dettagliata per la costruzione, il pacchetto, e purificare i vettori rAAV9 è descritto. L'iniezione sottocutanea di rAAV9 in cuccioli neonatali traduce in espressione robusta o efficiente knockdown del gene (s) di interesse nel cuore del mouse, ma non nel fegato e in altri tessuti. Utilizzando la cardiaco-specific TnnT2 promotore, alta espressione del gene GFP nel cuore è stato ottenuto. Inoltre, mRNA è stato inibito nel cuore, quando un rAAV9-U6-shRNA è stato utilizzato. Lavorando conoscenza della tecnologia rAAV9 può essere utile per le indagini cardiovascolari.
Introduction
Controllo dell'espressione o dell'attività di geni specifici in vari sistemi biologici è diventato una strategia valida nello studio della funzione genica 1. Un mezzo diretto di realizzazione di questo obiettivo è quello di manipolare sequenze nucleotidiche e generare alleli mutanti. Anche se fare precise, modifiche mirate al genoma delle cellule viventi è ancora un tempo e la pratica alta intensità di lavoro, lo sviluppo di potenti strumenti Talen e CRISPR / Cas9 ha aperto una nuova era di editing genoma 2-5. Un metodo di laboratorio di routine di più per la manipolazione genetica si è concentrata sull'introduzione di materiale genetico (DNA e RNA che contengono sequenze codificanti o siRNA / shRNAs) nelle cellule per esprimere o caduta del gene (s) di interesse 1,6.
In molti casi, il principale ostacolo manipolazione genetica è la consegna di DNA, RNA, o proteine nelle cellule. Per quanto riguarda gli studi in vitro, transfecti efficienteNei sistemi sono stati istituiti in molte linee di cellule in coltura. Tuttavia, nel modello murino in particolare, in vivo consegna del gene è più impegnativo. Ci sono una serie di barriere extra-intracellulari e che devono essere bypassato per conseguire efficace assorbimento cellulare dei reagenti esogeni. Ostacoli aggiuntivi includono la rapida clearance e la breve durata dei materiali 7,8 consegnato. Una strategia per aggirare questi problemi è quello di utilizzare vettori virali come "portatori" o "veicoli" per in vivo consegna del gene. Le proprietà di trasduzione naturalmente evoluti di virus consentono la fornitura efficiente di un gene di interesse in cellule 7,9,10. Numerosi tipi di vettori virali sono stati sviluppati e consentire flessibilità nella manipolazione genica in vivo in diversi tipi di cellule e organi topi.
I sistemi virali più comunemente utilizzati includono Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, e adeno-associato virus (AAV) <sup> 11. I retrovirus sono virus a singolo filamento di RNA e possono presentare il loro materiale genetico genoma della cellula ospite in modo stabile durante la divisione mitotica, fornendo la possibilità di espressione permanente dei geni trasdotte nelle cellule bersaglio e organi 12-14. Tuttavia, molti tipi di retrovirus infettano solo le cellule in divisione, e la loro efficacia in cellule non-divisione è molto bassa 15. Questo limita la loro utilità per la consegna del gene. Lentivirus è un genere della famiglia Retroviridae. Diverso da altri retrovirus, Lentivirus può infettare sia cellule in divisione e non di divisione ed è stato ampiamente utilizzato per il trasferimento genico in post-mitotico e cellule altamente differenziate-16. Il ciclo di vita di Lentivirus coinvolge anche l'integrazione del DNA vettore nel genoma dell'ospite. Gene delivery Così, Lentivirus-mediata consente espressione stabile e di lunga durata degli elementi genetici trasdotte 16-18. Tuttavia, questa caratteristica può rappresentare un doppio-espada dged nell'uso di questi virus per manipolare l'espressione genica, come integrazione di DNA vettoriale può portare a mutagenesi inserzionale nelle cellule ospiti e può causare effetti artefattuali. Adenovirus è un altro sistema di consegna del gene ampiamente utilizzato. A differenza dei retrovirus e lentivirus, Adenovirus sono non integrati e non interferiscono con l'integrità genomica delle cellule ospiti 8,10,11,19. Inoltre, adenovirus può trasfezione di DNA in molti tipi di cellule, e l'infezione non dipende divisione cellulare attiva 19. Un'altra caratteristica importante di adenovirus è la facilità di purificazione vettoriale, come i vettori virali hanno la capacità di essere replicato 19,20. Tuttavia, l'avvertimento importante di questo sistema è che l'infezione da adenovirus può innescare forti risposte immunitarie cellule bersaglio e organi 19, limitando il suo utilizzo in molte indagini, in particolare studi di terapia genica.
Rispetto a queste tipo diversos di vettori virali, virus ricombinante adeno-associato (rAAV) sembra essere il sistema di erogazione del gene ideale 21,22. Esibisce immunogenicità minimale e patogenicità 23,24. Inoltre, rAAV infetta una vasta gamma di tipi di cellule, inclusi sia demarcazione e cellule non-dividendo. Nella maggior parte dei casi, rAAV non si integra nel genoma di accoglienza; in tal modo, il rischio di cambiamenti genetici o genomiche indesiderate nelle cellule bersaglio è bassa 22.
Recentemente, i sistemi rAAV sono stati utilizzati con successo per la consegna in vivo di proteine di codifica del DNA, miRNA, shRNAs, e CRISPR-gRNAs in un mouse muscolo cardiaco 23,25-29. Questa metodologia è facilitato ricerche fondamentali e studi di terapia genica nel campo della ricerca cardiovascolare. Qui, la procedura dettagliata per generare vettori rAAV9 che iperesprimono efficiente o Knockdown i geni di interesse nei cuori del mouse è stato descritto. Il protocollo fornisce un metodo semplice ed efficacemanipolazione genica cardiaca in modelli sperimentali murini.
Protocol
Representative Results
Discussion
È importante minimizzare indesiderato ricombinazione ITR durante la costruzione del plasmide. Prima di generare il virus, si deve sempre monitorare l'integrità ITR dei plasmidi AAV utilizzando restrizione digestione e elettroforesi su gel di agarosio. È impossibile ottenere 100% plasmidi intatte, ma il rapporto ricombinazione dovrebbe essere minimizzata il più possibile. Meno del 20% è accettabile per l'imballaggio rAAV9 successo. Da segnalare, la coltura dei batteri, a temperatura più bassa (30 ° C), con…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
Riferimenti
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