Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Biofilm består af grupper af bakterier indkapslet i en selvstændig udskilles matrix. De spiller en vigtig rolle i den industrielle forurening samt i udviklingen og vedvarende mange sundhedsrelaterede infektioner. En af de mest velbeskrevne og studeres biofilm i human sygdom opstår i kronisk lungeinfektion af patienter med cystisk fibrose. Når man undersøger biofilm i forbindelse med værten, kan mange faktorer påvirker biofilmdannelse og udvikling. For at identificere hvordan værtsfaktorer kan påvirke biofilm dannelse og udvikling, vi anvendte en statisk kamre dækglas metode til at vokse biofilm i nærværelse af værtsafledte faktorer i form af sputum supernatanter. Bakterier podes i kamre og udsat for opspyt filtrater. Efter 48 timers vækst, er biofilm farves med et kommercielt biofilm levedygtighed kit før konfokal mikroskopi og analyse. Efter overtagelsen billede, kan biofilm egenskaber vurderes ved hjælp af forskellige softwareplatforme.Denne fremgangsmåde tillader os at visualisere centrale egenskaber af biofilm vækst i nærværelse af forskellige stoffer, herunder antibiotika.
Introduction
Bakterielle biofilm er grupper af mikroorganismer, der er knyttet til hinanden og indkapslet i en selvstændig udskilles matrix. 1,2 Klassisk, de repræsenterer bakterier fysisk knyttet til en abiotisk eller biotisk overflade dannet under forhold med strøm. Biofilm har også vist sig at vokse i statiske forhold (fravær af flow) og distalt fra overflader, såsom ved luft-væske-grænsefladen af termiske puljer eller pellikeler dannet i reagensglas. Disse biofilm har længe været anerkendt i miljøet og er en vigtig ulempe for industrielle processer, som de kan dannes i vandreservoirer eller i rør, hvilket resulterer i biologisk forurening, korrosion og blokeringer. 3,4
Biofilm er også kritiske i sundhedsvæsenet, da de har vist være involveret i Kateter-relaterede infektioner, lungeinfektioner i patienter med cystisk fibrose, såvel som i mange andre infektioner. 5,6 Et af kendetegnene ved biofilm infektioner er deøget følsomhed af bakterier mod antibiotika og nedsat clearance af det medfødte immunsystem. 7-9 Den mest velundersøgte, klinisk relevante scenarier involverer biofilm-baserede infektion forekommer hos patienter med cystisk fibrose (CF), som er kronisk inficeret med Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa kan undergå en række ændringer under etablering af kronisk infektion, der gør det meget vanskeligt at behandle. 10,11 Biofilm kan forskelligt aktivere medfødte immunitet og drive inflammation. 12-14 Da disse infektioner fører til øget sygelighed og dødelighed i CF-patienter, er det afgørende at forstå faktorer, der kan påvirke biofilm udvikling i denne sammenhæng.
En nylig undersøgelse viser, at værten-faktorer er kritiske i dannelsen af P. aeruginosa biofilm aggregater. 15 Disse biofilm bidrage til nedsat følsomhed over for antibiotika og vært forsvarsmekanismer. Den presence af værtsafledte faktorer, såsom neutrofil elastase, samt udskilte produkter fra mikroorganismer til stede i CF lungen, har potentiale til i høj grad at modulere biofilm dannelse og udvikling. 16 Derudover biofilm interagerer med værten til at modulere ekspression af mange veje og initiere inflammation. Mens høje throughput metoder, såsom standard krystalviolet assay, kan give nogle oplysninger med hensyn til biofilmen proces, visualisering af biofilmen som reaktion på disse faktorer giver mere dybdegående information.
I dette manuskript beskriver vi en fremgangsmåde til anvendelse faktorer fra spyt af patienter med CF at undersøge udviklingen af biofilm in vitro. Denne fremgangsmåde tillader hurtig visualisering af biofilm udsat for sputum indeholdende værtsfaktorer bruger kommercielt biofilm levedygtighed kit. Denne teknik kan anvendes til visuelt at identificere forandringer, der sker i løbet af biofilm vækst i nærvær af exogenoos produkter, og repræsenterer en forbedret metode til at analysere ændringerne i biofilm udvikling under forskellige forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
De heri beskrevne fremgangsmåder tillader visualisering af bakterielle biofilm dyrket i nærvær af exogene produkter. Ikke overraskende, at produktionen af de exoproducts er af betydning, når der anvendes denne type system. For eksempel dithiothreitol (DTT), anvendes ofte på menneskelige spytprøver til at hjælpe flydende prøverne. virkningen af DTT alene, kan imidlertid falde biofilm udvikling og levedygtighed (data ikke vist). Således ordentlig kontrol til alle betingelser er nødvendige. Desuden ka…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB anerkender et forskningsprojekt stipendium fra cystisk fibrose Canada.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
Riferimenti
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
