Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d'un modèle Chambered lamelle couvre-objet
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Les biofilms sont constitués de groupes de bactéries enrobées dans une matrice auto-sécrété. Ils jouent un rôle important dans la contamination industrielle, ainsi que dans le développement et la persistance de nombreuses infections liées à la santé. Un des biofilms plus bien décrits et étudiés dans les maladies humaines se produit dans l'infection pulmonaire chronique des patients atteints de fibrose kystique. Lors de l'étude des biofilms dans le contexte de l'hôte, de nombreux facteurs peuvent influer sur la formation et le développement de biofilm. Afin d'identifier comment les facteurs de l'hôte peuvent affecter la formation de biofilm et de développement, nous avons utilisé une méthode coverglass chambré statique de croître biofilms en présence de facteurs de l'hôte dérivé sous forme de surnageants d'expectorations. Les bactéries sont ensemencées dans des chambres et exposées à filtrats expectorations. À la suite de 48 h de croissance, les biofilms sont colorées avec un kit de viabilité commerciale du biofilm avant la microscopie et l'analyse confocale. Suite à l'acquisition de l'image, les propriétés biofilm peuvent être évaluées en utilisant différentes plates-formes logicielles.Cette méthode nous permet de visualiser les propriétés clés de la croissance du biofilm en présence de différentes substances, notamment des antibiotiques.
Introduction
biofilms bactériens sont des groupes de micro-organismes qui sont reliés les uns aux autres et enfermés dans une matrice auto-sécrété. 1,2 Classiquement, ils représentent les bactéries physiquement attachés à une surface abiotique ou biotique formé dans des conditions d'écoulement. Biofilms ont également été montré à croître dans des conditions statiques (absence d'écoulement) et distal par rapport à des surfaces, par exemple à l'interface air-liquide des piscines thermales ou aux pellicules formées dans des tubes à essai. Ces biofilms sont reconnus depuis longtemps dans l'environnement et sont un préjudice important aux procédés industriels, car ils peuvent se former dans les réservoirs d'eau ou dans les tuyaux, ce qui entraîne l'encrassement biologique, la corrosion et les blocages. 3,4
Les biofilms sont également critiques dans les milieux de soins de santé, comme il a été démontré être impliqués dans les infections liées au cathéter, les infections pulmonaires chez les patients atteints de fibrose kystique, ainsi que dans de nombreuses autres infections. 5,6 L' une des caractéristiques des infections biofilm est le deaugmenté la sensibilité des bactéries aux antibiotiques et une altération de la clairance par le système immunitaire inné. 7-9 Le plus bien étudiés, des scénarios cliniquement pertinentes impliquant une infection à base biofilm se produit chez les patients atteints de fibrose kystique (FK), qui sont chroniquement infectés par Pseudomonas biofilms aeruginosa. P. aeruginosa peut subir un certain nombre de changements lors de l' établissement d' une infection chronique qui le rendent très difficile à traiter. 10,11 biofilms peuvent différentiellement activer l' immunité innée et conduire l' inflammation. 12-14 Comme ces infections conduisent à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose, il est essentiel de comprendre les facteurs qui peuvent influer sur le développement du biofilm dans ce contexte.
Une étude récente suggère que l' hôte facteurs sont essentiels à la formation de P. aeruginosa agrégats de biofilm. 15 Ces biofilms contribuent à une sensibilité réduite aux antibiotiques et les mécanismes de défense de l' hôte. Le presence de facteurs dérivées de l'hôte, telles que l'élastase neutrophile, ainsi que les produits sécrétés à partir de micro-organismes présents dans le poumon CF, ont la capacité de moduler considérablement la formation de biofilm et de développement. 16 En outre, les biofilms interagir avec l'hôte pour moduler l' expression de nombreuses voies et initier l' inflammation. Bien que les méthodes à haut débit, tels que le test de cristal violet standard, peuvent fournir des informations en ce qui concerne le processus de biofilm, la visualisation du biofilm en réponse à ces facteurs fournissent plus d'informations en profondeur.
Dans ce manuscrit , nous décrivons une méthode d'utilisation des facteurs de l'expectoration des patients atteints de mucoviscidose pour étudier le développement de biofilms in vitro. Cette méthode permet une visualisation rapide des biofilms exposés à des crachats contenant des facteurs de l'hôte en utilisant un kit biofilm viabilité commerciale. Cette technique peut être utilisée pour identifier visuellement des changements qui se produisent lors de la croissance du biofilm en présence d'exógenonous produits, et représente une méthode améliorée pour analyser les changements dans le développement du biofilm dans diverses conditions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les procédés décrits ici permettent une visualisation des biofilms bactériens cultivés en présence de produits exogènes. Sans surprise, la production des exoproducts est d'une importance lors de l'utilisation de ce type de système. Par exemple, dithiothréitol (DTT), est souvent utilisé sur des échantillons de crachats humains pour aider à liquéfier les échantillons. Cependant, l'effet de DTT seul peut réduire le développement de biofilm et la viabilité (données non présentées). Ainsi, des…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB reconnaît une bourse de recherche de Fibrose kystique Canada.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
Riferimenti
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