チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
バイオフィルムは、自己分泌マトリックスに包まれた細菌のグループで構成されています。彼らは、工業汚染だけでなく、多くの健康に関連する感染症の発症と持続に重要な役割を果たしています。ヒトの疾患の中で最もよく説明し、研究バイオフィルムの一つは、嚢胞性線維症患者の慢性肺感染症で発生します。ホストのコンテキストでバイオフィルムを研究すると、多くの要因は、バイオフィルム形成と発展に影響を与えることができます。宿主因子はバイオフィルムの形成及び発達に影響を与えることができる方法を同定するために、我々は、痰上清の形で宿主由来因子の存在下でバイオフィルムを成長させるために、静的チェンカバーガラスの方法を使用しました。細菌は、チャンバーに播種し、痰ろ液にさらされています。成長の48時間後に、バイオフィルムは、共焦点顕微鏡および分析の前に商業バイオフィルムの生存率キットで染色されています。画像取得後、バイオフィルムの特性は、異なるソフトウェア・プラットフォームを用いて評価することができます。この方法は、私たちは、抗生物質などの異なる物質の存在下でのバイオフィルムの成長の重要な特性を視覚化することができます。
Introduction
細菌バイオフィルムは、互いに結合し、自己分泌マトリックスに包まれている微生物の基です。 1,2古典的には、それらが物理的に流れの条件の下で形成された非生物または生物の表面に付着した細菌を表します。バイオフィルムはまた、試験管内で形成された熱プールまたはペリクルの空気 – 液体界面でのような表面からの静的条件（流れの欠如）および遠位で成長することが示されています。これらのバイオフィルムは、長い環境で認識され、彼らは生物付着、腐食や閉塞が生じ、貯水池内またはパイプで形成することができるよう、産業プロセスへの主要な不利益であるされています。 3,4
彼らはカテーテル関連感染症、嚢胞性線維症の患者では、だけでなく、多数の他の感染症における肺感染症に関与することが示されているようにバイオフィルムは、また、医療現場で重要です。 5,6バイオフィルム感染症の特徴の一つは、デです抗生物質に対する細菌の感受性を折り目と自然免疫系によるクリアランスを損ないます。バイオフィルムベースの感染を伴う7-9で最もよく研究され、臨床的に関連するシナリオが慢性的に緑膿菌バイオフィルムに感染している嚢胞性線維症（CF）の患者に起こります。 緑膿菌は、それが非常に困難治療することを可能にする慢性感染症の確立中に変更の数を受けることができます。 10,11バイオフィルムは、示差的に先天性免疫を活性化し、炎症を駆動することができます。 12-14これらの感染症は、CF患者において増加罹患率および死亡率につながるように、この文脈では、バイオフィルム発達に影響を与えることができる因子を理解することが重要です。
最近の研究は、宿主因子が緑膿菌バイオフィルムの凝集体の形成に重要であることを示唆しています。 15これらのバイオフィルムは、抗生物質および宿主防御機構に対する感受性の低下に貢献しています。 presaの複数形CF肺中に存在する微生物から、このような好中球エラスターゼなどの宿主由来因子、ならびに分泌物のNCEは、大幅にバイオフィルム形成と発展を調節する可能性を秘めています。 16はまた、バイオフィルムは、多数の経路の発現を調節し、炎症を開始するためにホストと対話します。標準的なクリスタルバイオレットアッセイ等のハイスループット方法が、バイオフィルムの処理に関していくつかの情報を提供することができ、これらの因子に応答したバイオフィルムの可視化は、より詳細な情報を提供します。
本稿では、 インビトロでのバイオフィルムの発達を研究するためにCF患者の痰からの係数を使用する方法を記載しています。この方法は、市販のバイオフィルムの生存率キットを使用して痰を含む宿主因子に曝露されたバイオフィルムの迅速な可視化を可能にします。この技術は、視覚的にexogenoの存在下でのバイオフィルムの成長中に発生する変化を同定するために使用され得ます私たちの製品、および様々な条件下でのバイオフィルムの開発の変化を分析するための改良された方法を表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載される方法は、外因性生成物の存在下で増殖させた細菌性バイオフィルムの可視化を可能にします。このタイプのシステムを使用する場合に当然のことながら、exoproductsの生産が重要です。例えば、ジチオスレイトール（DTT）は、多くの場合、サンプルを液化するために役立つ人間の唾液サンプルに使用されています。しかし、単独でDTTの効果は、バイオフィルムの発達およ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TBは、嚢胞性線維症、カナダからの研究フェローシップを認めています。
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
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