Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Biofilm består av grupper av bakterier innkapslet i en selv utskilt matrise. De spiller en viktig rolle i industriell forurensning samt i utvikling og utholdenhet av mange helserelaterte infeksjoner. En av de mest godt beskrevet og undersøkt biofilm i human sykdom oppstår ved kronisk pulmonar infeksjon i cystisk fibrose pasienter. Når man studerer biofilm i sammenheng med verten, kan mange faktorer påvirker biofilmdannelse og utvikling. For å identifisere hvordan vertsfaktorer kan påvirke biofilmdannelse og utvikling, ble det benyttet en statisk kammer, dekkglass metode for å dyrke biofilmer i nærvær av verts-avledede faktorer i form av sputum-supernatanter. Bakterier blir sådd inn i kammer og utsatt for sputum filtrater. Etter 48 timer med vekst, er biofilm farget med et kommersielt biofilm levedyktighet kit før konfokal mikroskopi og analyse. Etter bilde oppkjøpet, kan biofilm egenskaper vurderes ved hjelp av ulike programvareplattformer.Denne metoden tillater oss å visualisere viktige egenskaper biofilm vekst i nærvær av forskjellige stoffer, inkludert antibiotika.
Introduction
Bakterielle biofilmer er grupper av mikroorganismer som er festet til hverandre og innkapslet i et selv utskilt matrise. 1,2 klassisk, representerer de bakterier fysisk festet til en abiotiske eller biotiske overflaten dannet under forhold med flyt. Biofilm har også vist seg å vokse i statiske betingelser (fravær av strømning) og distal fra overflater, slik som ved luft-væske-grensesnittet av termiske bassenger eller pellicles dannet i reagensglass. Disse biofilm har lenge vært anerkjent i miljøet og er en stor ulempe for industrielle prosesser, som de kan dannes i vannreservoarer eller i rør, noe som resulterer i begroing, korrosjon og blokkeringer. 3,4
Biofilmer er også avgjørende i helsevesenet, ettersom de har vist seg være involvert i kateterrelaterte infeksjoner, lungeinfeksjoner hos pasienter med cystisk fibrose, så vel som i en rekke andre infeksjoner. 5,6 Ett av kjennetegnene på biofilm infeksjoner er deøkt mottakelighet av bakterier mot antibiotika og nedsatt clearance av det medfødte immunsystemet. 7-9 Den mest studerte, klinisk relevante scenarier med biofilm-basert infeksjon oppstår hos pasienter med cystisk fibrose (CF), som er kronisk infisert med Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa kan gjennomgå en rekke endringer i løpet av opprettelsen av kronisk infeksjon som gjør det svært vanskelig å behandle. 10,11 Biofilm kan forskjellig aktivere medfødt immunitet og kjøre betennelse. 12-14 Ettersom disse infeksjoner føre til økt sykelighet og dødelighet hos CF-pasienter, er det viktig å forstå faktorer som kan påvirke biofilm utvikling i denne sammenheng.
En fersk studie antyder at verts-faktorer er avgjørende i dannelsen av P. aeruginosa biofilm aggregater. 15 Disse biofilm bidra til redusert følsomhet for antibiotika og vertsforsvarsmekanismer. den presence av vert-avledede faktorer, slik som nøytrofil elastase, så vel som utskilte produkter fra mikroorganismer som er tilstede i CF-lunge, har potensial til å betydelig modulere biofilmdannelse og utvikling. 16 I tillegg biofilmer kommuniserer med verten for å modulere ekspresjon av tallrike veier og initiere betennelse. Mens høy gjennomstrømning metoder, slik som standard krystallfiolett analyse, kan gi noen informasjon med hensyn til biofilm-prosessen, visualisering av biofilmen som reaksjon på disse faktorene gi mer detaljert informasjon.
I dette manuskriptet beskriver vi en fremgangsmåte for å anvende forhold fra sputum av pasienter med CF for å studere utviklingen av biofilm in vitro. Denne metoden gjør det mulig for rask visualisering av biofilm utsatt for spytt inneholder vertsfaktorer ved bruk av et kommersielt biofilm levedyktighet kit. Denne teknikken kan brukes til visuelt å identifisere endringer som skjer i løpet av biofilmveksten i nærvær av exogenooss produkter, og representerer en forbedret metode for å analysere endringer i biofilm-utvikling under ulike forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåtene beskrevet heri tillater visualisering av bakterielle biofilmer dyrket i nærvær av eksogene produkter. Ikke overraskende, er produksjonen av exoproducts av viktighet ved bruk av denne type system. For eksempel ditiotreitol (DTT), blir ofte brukt på human spyttprøver for å bidra til å flytendegjøre prøvene. Imidlertid kan virkningen av DTT alene redusere biofilm utvikling og levedyktighet (data ikke vist). Dermed riktige kontroller for alle forhold er nødvendig. Videre er tilsetningen av human sp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB erkjenner en stipendiatstilling fra cystisk fibrose Canada.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
Riferimenti
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
