Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Biofilmer består av grupper av bakterier inneslutna i en själv utsöndras matris. De spelar en viktig roll i den industriella föroreningar samt i utvecklingen och uthållighet av många hälsorelaterade infektioner. En av de mest väl beskrivna och studerade biofilmer i mänskliga sjukdomar förekommer i kronisk lunginfektion av patienter med cystisk fibros. När man studerar biofilmer i samband med värden, kan många faktorer påverkar biofilm formation och utveckling. För att identifiera hur värdfaktorer kan påverka biofilm bildning och utveckling, använde vi en statisk kammarcoverglass metod för att växa biofilm i närvaro av värdhärledda faktorer i form av sputum supernatanter. Bakterier ympas in kammare och utsätts för sputum filtraten. Efter 48 timmar av tillväxt, är biofilmer färgades med en kommersiell biofilm lönsamhet kit innan konfokalmikroskopi och analys. Efter bildtagning, kan biofilm egenskaper bedömas med hjälp av olika mjukvaruplattformar.Denna metod gör det möjligt att visualisera de viktigaste egenskaperna hos biofilm tillväxt i närvaro av olika ämnen inklusive antibiotika.
Introduction
Bakteriella biofilmer är grupper av mikroorganismer som är kopplade till varandra och inneslutna i en själv utsöndras matris. 1,2 Klassiskt, de representerar bakterier fysiskt bundna till en abiotisk eller biotiska yta som bildas under förhållanden med flöde. Biofilmer har också visat att växa under statiska förhållanden (avsaknad av flöde) och distalt från ytor, såsom vid luft-vätske-gränssnittet för termalbad eller pellicles bildats i provrör. Dessa biofilmer har länge varit känt i miljön och är en stor nackdel för industriella processer, eftersom de kan bildas i vattenmagasinen eller i rör, vilket resulterar i biobeväxning, korrosion och blockeringar. 3,4
Biofilmer är också kritisk i vårdmiljöer, eftersom de har visats vara inblandade i kateterrelaterade infektioner, lunginfektioner hos patienter med cystisk fibros, liksom i många andra infektioner. 5,6 Ett av kännetecknen för biofilminfektioner är deökad känslighet för bakterier mot antibiotika och försämrad clearance av det medfödda immunförsvaret. 7-9 Den mest studerade, kliniskt relevanta scenarier med biofilm-baserad infektion uppstår hos patienter med cystisk fibros (CF), som är kroniskt infekterade med Pseudomonas aeruginosa biofilmer. P. aeruginosa kan genomgå ett antal förändringar under etablering av kronisk infektion som gör det mycket svårt att behandla. 10,11 Biofilmer kan differentiellt aktivera medfödd immunitet och driva inflammation. 12-14 Eftersom dessa infektioner leder till ökad sjuklighet och dödlighet i CF-patienter, är det viktigt att förstå faktorer som kan påverka biofilm utveckling i detta sammanhang.
En nyligen genomförd studie visar att värdfaktorer är kritiska i bildandet av P. aeruginosa biofilm aggregat. 15 Dessa biofilmer bidra till minskad känslighet för antibiotika och värd försvarsmekanismer. den preseiou av värdhärledda faktorer, såsom neutrofilelastas, såväl som utsöndrade produkter från mikroorganismer som finns i CF lungan, har potential att i hög grad modulera biofilmbildning och utveckling. 16 Dessutom biofilmer interagerar med värden för att modulera uttrycket av många vägar och initiera inflammation. Medan high throughput metoder, såsom standardkristallviolett analys kan ge viss information med avseende på biofilmsprocessen, visualisering av biofilm som svar på dessa faktorer ger mer detaljerad information.
I detta manuskript beskriver vi en metod för att använda faktorer från sputum från patienter med CF för att studera utvecklingen av biofilmer in vitro. Denna metod möjliggör snabb visualisering av biofilmer som utsätts för sputum innehållande värdfaktorer med hjälp av en kommersiell biofilm lönsamhet kit. Denna teknik kan användas för att visuellt identifiera förändringar som sker under biofilm tillväxt i närvaro av exogenooss produkter, och representerar en förbättrad metod för att analysera förändringar i biofilm utveckling under olika förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som beskrivs häri medger visualisering av bakteriella biofilmer som odlats i närvaro av exogena produkter. Inte överraskande, är produktionen av exoproducts av betydelse när man använder denna typ av system. Exempelvis ditiotreitol (DTT), används ofta på humana sputumprover att hjälpa vätskeform proverna. Däremot kan effekten av DTT enbart minska biofilm utveckling och lönsamhet (data visas ej). Således, ordentliga kontroller för alla villkor är nödvändiga. Vidare tillsatsen av humant slem pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB erkänner en forskartjänst från cystisk fibros Kanada.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
Riferimenti
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
