हम यहाँ प्राप्त करने और न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न विशाल फ़ैगोसाइट की एक नव विशेषता उप-जनसंख्या की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन है। इन कोशिकाओं को नए सिरे से मानव रक्त न्यूट्रोफिल से संस्कृति में विकसित करने, और phagocytosis, भोजी, बेहद बड़े आकार, और विस्तारित उम्र की विशेषता है। इस विधि के आगे इस अनूठी न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न उप-जनसंख्या की जांच करने के लिए आवश्यक है।
न्यूट्रोफिल (PMN) सबसे अच्छा रोगजनकों और सूक्ष्मजीवों पर हमले के खिलाफ उनकी phagocytic कार्यों के लिए जाना जाता है। वे ल्यूकोसाइट्स के बीच और उनके गैर सक्रिय राज्य में अनिवार्यता से apoptosis के लिए प्रतिबद्ध हैं कम से कम आधा जीवन है। जब सूजन को हल करने के लिए भड़काऊ साइटों के लिए भर्ती किया, वे शक्तिशाली रोगाणुरोधी हत्या के साथ साइटोटोक्सिक अणुओं की एक सरणी का उत्पादन। फिर भी, जब इन शक्तिशाली साइटोटोक्सिक अणुओं एक अनियंत्रित ढंग से जारी कर रहे हैं वे आसपास के ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। हालांकि हाल के वर्षों में, न्यूट्रोफिल बहुमुखी प्रतिभा तेजी से plasticity और immunoregulatory कार्यों का प्रदर्शन इसका सबूत है। हमने हाल ही में एक नया न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न उप-जनसंख्या है, जो इस तरह के granulocyte कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के रूप में साइटोकिन्स / विकास कारकों के अलावा बिना मानक संस्कृति की स्थिति में अनायास विकसित / इंटरल्यूकिन (IL) -4 की पहचान की है। न्यूट्रोफिल अवशेष की उनकी क्षमताओं phagocytic काफी हद तक उनकी वृद्धि करने के लिए योगदानबेहद आकार; इसलिए वे करार दिया गया था विशाल फ़ैगोसाइट (Gφ)। न्यूट्रोफिल के विपरीत, Gφ लंबे संस्कृति में रहते हैं। वे भेदभाव (सीडी) न्युट्रोफिल मार्कर CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myeloperoxidase (एमपीओ) / न्युट्रोफिल इलास्टेज (पूर्वोत्तर) के क्लस्टर एक्सप्रेस, और / CD16 / CD163 और वृक्ष के समान CD1c / CD141 मार्कर monocytic वंश मार्कर CD14 से रहित हैं । उन्होंने यह भी ले अप लेटेक्स और zymosan, और opsonized-zymosan और पीएमए के साथ उत्तेजना को ऑक्सीडेटिव फट से जवाब। Gφ भी अभिव्यक्त मेहतर रिसेप्टर्स CD68 / CD36, और न्यूट्रोफिल के विपरीत, भली ऑक्सीकरण-कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (oxLDL)। इसके अलावा, ताजा न्यूट्रोफिल, या सुसंस्कृत monocytes के विपरीत, वे oxLDL तेज करने के लिए बढ़ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन से जवाब। इसके अतिरिक्त, इन फ़ैगोसाइट, microtubule जुड़े प्रोटीन -1 प्रकाश श्रृंखला 3 बी (LC3B) लेपित रिक्तिकाएं शामिल भोजी की सक्रियता के संकेत मिलते हैं। विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग करते हुए यह स्पष्ट है कि दोनों phagocytosis और भोजी prerequisi हैंउनके विकास और संभावना NADPH निर्भर आरओएस oxidase के लिए टीईएस। हम यहाँ संस्कृति में लंबे समय रहते, न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न phagocytic कोशिकाओं, उनकी पहचान और उनके वर्तमान में जाना जाता विशेषताओं के इस नए उप-जनसंख्या की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन। इस प्रोटोकॉल प्राप्त करने और Gφ निस्र्पक क्रम में आगे उनके महत्व और कार्यों की जांच करने के लिए आवश्यक है।
Polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (PMN) रक्त में ल्यूकोसाइट्स की सबसे बड़ी आबादी का गठन, साइटोटोक्सिक अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला का निर्माण करके रोगजनकों पर हमले के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में सेवारत। परंपरागत दृष्टिकोण लंबे रक्त घूम, कम रहता है, पेशेवर फ़ैगोसाइट है, जो पहले रोगज़नक़ों और हानिकारक कणों की निकासी में संक्रमण और सहायता मुकाबला करने के लिए तीव्र भड़काऊ साइट्स के लिए आने के लिए कर रहे हैं की है कि कर दिया गया है। 1 उनके गैर सक्रिय राज्य में, न्यूट्रोफिल अनिवार्यता से apoptosis के लिए प्रतिबद्ध हैं। जब भड़काऊ साइटों को रक्त से पलायन, न्यूट्रोफिल सूजन को हल करने के लिए सक्रियण गुज़रना पड़ता है। वे phagocytose और सूक्ष्मजीवों हमलावर को मारने, ऐसे न्युट्रोफिल इलास्टेज (पूर्वोत्तर) और शक्तिशाली microbicidal गतिविधि के साथ cathepsins के रूप में साइटोटोक्सिक अणुओं के रूप में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), अपघट्य एंजाइमों की एक सरणी का निर्माण करके। जाल रोगजनकों के लिए आदेश में, न्यूट्रोफिल भी कोशिकी जाल (जाल रिलीज) जो परमाणु क्रोमेटिन धागे जीवाणुरोधी पेप्टाइड्स और विभिन्न अपघट्य एंजाइमों युक्त से मिलकर बनता है। हालांकि, न्यूट्रोफिल से इन साइटोटोक्सिक अणुओं के अनियंत्रित रिलीज भी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने और आसपास के ऊतकों को नुकसान उत्पन्न हो सकता है। 2 इसलिए, मैक्रोफेज द्वारा एक प्रभावी apoptotic न्यूट्रोफिल की निकासी (Mφ) और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) सूजन को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है। 3, 4, 5, 6
हालांकि हाल के वर्षों में, यह तेजी से स्पष्ट है कि न्यूट्रोफिल अत्यधिक बहुमुखी कोशिकाओं, जिसका कार्य अब तक phagocytosis और रोगज़नक़ हत्या से परे जा रहे हैं बन गया है। 6, 7 भड़काना या सक्रियण के दौर से गुजर करके, न्यूट्रोफिल प्लास्टिसिटी धीरे-धीरे ध्यान प्राप्त कर रहा है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया और माइक्रोबैक्टीरिया चुनौती दी न्यूट्रोफिल को दिखाया गयाइंटरल्यूकिन (IL) -10 छिपाना और भड़काऊ प्रतिक्रिया को नियंत्रित, इम्युनो-विनियामक प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति का सुझाव दे। 8 बाद mitotic न्यूट्रोफिल को दिखाया गया Mφ कोशिकाओं की तरह, या पचाने और प्रतिजन टुकड़े पेश जब साइटोकिन्स और वृद्धि कारकों, 9, 10, इस प्रकार के साथ इलाज किया, सहज और अनुकूली को एकीकृत करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा करके डीसी की तरह कोशिकाओं में ट्रांस-अलग पहचान हिमायती हैं। 3, 6 एक्टिवेशन विकास कारकों से apoptotic न्यूट्रोफिल या सेल मलबे, जिससे की घिराव पदोन्नत, भड़काऊ स्थलों पर मलबे की निकासी और सूजन का संकल्प, 3, 9, खासकर जब Mφ / डीसी निकासी की व्यवस्था, अपर्याप्त या अभिभूत है 11, 12 की सुविधा सुझाव संभावित 'आत्म नियमन' फिर से मदद करने के लिएभड़काऊ प्रतिक्रिया का समाधान। यह apoptosis के बाद से विनियमित आत्म-मृत्यु जो साइटोटोक्सिक यौगिकों के बाह्य रिहाई रोकना है और इस तरह आसपास के ऊतकों को चोट रोका जा सकता का एक रूप है। 6
लंबे समय तक जीवित रहने के न्युट्रोफिल सक्रियण की एक और विशेषता है और इस तरह granulocyte कॉलोनी उत्तेजक कारक (जी-सीएसएफ), granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), ऐसे इंटरफेरॉन के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स (के रूप में विभिन्न मेजबान ली गई कारकों के साथ इलाज के द्वारा प्रदर्शन किया गया IFN) -γ, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNF) -α और / या रोगज़नक़ व्युत्पन्न उत्पादों, इस प्रकार, न्यूट्रोफिल अपने अस्तित्व प्रतिक्रिया मिलाना करने की इजाजत दी। 6 वास्तव में, न्युट्रोफिल अस्तित्व इसके plasticity के लिए एक शर्त है और phagocytosis प्रदर्शन करने की क्षमता के साथ जुड़े थे। 6, 13 तदनुसार, यह भी प्ररूपी और कार्यात्मक परिवर्तन जो निर्भरता के साथ संबद्ध करने के लिए दिखाया गया थानई न्यूट्रोफिल उम्र विस्तार में शामिल प्रोटीन के संश्लेषण उत्प्रेरण द्वारा upregulated जीन अभिव्यक्ति, और कम apoptosis पर देद। 10
न्यूट्रोफिल जो अल्पकालिक होते हैं और अनिवार्यता से संस्कृति में apoptosis से गुजरना है, या साइटोकिन्स / वृद्धि कारक सक्रिय न्यूट्रोफिल, ऊपर वर्णित है, जो जीवन काल बढ़ाया है के विपरीत, हम हाल ही में न्यूट्रोफिल का एक नया, छोटे उप-जनसंख्या है कि लंबे समय तक मानक संस्कृति में अनायास विकसित की पहचान की है बाह्य साइटोकिन्स या विकास के कारकों को जोड़ने के बिना हौसले से पृथक मानव रक्त न्यूट्रोफिल से की स्थिति। 14 ये न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न कोशिकाओं है, जो साहित्य में वर्णित से पहले नहीं थे करार दिया गया था विशाल फ़ैगोसाइट (Gφ)। Gφ संस्कृति में उम्र बढ़ा दिया है, वे पूरी तरह से 5-7 दिनों के भीतर विकसित कर रहे हैं, और अद्वितीय रूपात्मक सुविधाओं, प्ररूपी अभिव्यक्ति और कार्यों की विशेषता है। वे बेहद autophago के कारण बढ़ा रहे हैंमृत न्यूट्रोफिल अवशेष, vacuolated की cytosis, और उसमें phagolysosomes। Gφ विशिष्ट न्यूट्रोफिल कणिकाओं मार्कर व्यक्त – भेदभाव (सीडी) 66B के क्लस्टर, azurophilic कणिकाओं मार्कर – CD63 और myeloperoxidase (एमपीओ) और ऐसे CD11b, पूर्वोत्तर, CD15, के रूप में अतिरिक्त न्यूट्रोफिल मार्कर NADPH oxidase सब यूनिटों gp91- phox और p22- phox, और भोजी मार्कर -LC3BII। 14, 15 कार्यात्मक, वे सक्रिय रूप से ले अप लेटेक्स माला और zymosan कणों, और zymosan और phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) उत्तेजना के जवाब में आरओएस उत्पन्न करते हैं। दिलचस्प है, ताजा न्यूट्रोफिल के विपरीत, Gφ भी अधिकता मेहतर रिसेप्टर्स CD68 और CD36 एक्सप्रेस, ले अप कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (oxLDL) ऑक्सीकरण, और oxLDL साथ उत्तेजना के जवाब में आरओएस उत्पन्न करते हैं। इसके अतिरिक्त, Gφ monocytic वंश मार्कर CD14, CD16 और CD163 या वृक्ष के समान मार्कर CD1c और CD141 से रहित हैं। इसके अलावा, पीएचएgocytosis और भोजी की संभावना है और कार्यात्मक NADPH oxidase उनके विकास के लिए आवश्यक शर्तें हैं। इस के बाद से, phagocytosis-अवरोध cytochalsin बी, भोजी अवरोधकों 3-methyladenine (3-एमए) और bafilomycin (BafA1) और NADPH oxidase अवरोध – diphenylene iodonium (डीपीआई) – उनके विकास को रोका। इसके अतिरिक्त, monocytes / न्यूट्रोफिल सह संस्कृतियों के साथ ही उनके विकास में बाधा उत्पन्न रुक-रुक कर हाइपोक्सिया के लिए जोखिम है, जबकि निरंतर हाइपोक्सिया के लिए न्युट्रोफिल अनुकूलन स्पष्ट हो गया था। 14,15 संस्कृति में अपने सुझाव विकास वर्तमान पत्र में चित्रा 1 व्याप्ति प्रोटोकॉल में सचित्र है कदम से कदम से Gφ की तैयारी का वर्णन हौसले मानव रक्त न्यूट्रोफिल, उनके विकास, पहचान और कुछ बुनियादी विशेषताओं घूम अलग। इस प्रोटोकॉल के लिए और आगे की जांच और व्यापक स्पेक्ट्रम प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की भूमिकाओं इन नव वर्णित और पेचीदा न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न क्रम में Gφ characteriz करने के लिएउनके महत्व और उनके संभावित कार्यों ई।
चित्रा 1: 7 दिवस न्युट्रोफिल संस्कृति में विशाल कोशिकाओं के विकास की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह सुझाव दिया है कि भड़काऊ स्थलों पर (1) न्यूट्रोफिल apoptotic कोशिका मृत्यु से गुजरना है, और (2) रिहाई झिल्ली घेर लिया परमाणु मलबे, कणिकाओं (हरे और लाल डॉट्स) युक्त टुकड़े, और अन्य subcellular घटक जो भोजी तंत्र ट्रिगर। (3) विशाल फ़ैगोसाइट (Gφ), लंबी अवधि के न्यूट्रोफिल साइटोकिन्स या apoptotic निकायों और न्यूट्रोफिल मलबे internalizing द्वारा विकास के कारकों से रहित संस्कृतियों में विकसित जबकि बनाए रखने कार्यात्मक NADPH oxidase.They विभिन्न neutrophilic CD66b + / CD63 की विशेषता है + / एमपीओ + / CD15 + / CD11b + / पूर्वोत्तर मार्कर, बड़े कणिकाओं और सेल मलबे, और मेहतर रिसेप्टर्स CD36 और CD68 संलग्न phagosomes। जीबी1; ज्यादातर mononucleated कोशिकाओं, भी विभिन्न कणों और ऑक्सीकरण एलडीएल internalizing में सक्षम हैं और आरओएस उत्पन्न करते हैं। रिक्तिकाएं Gφ भरने की झिल्ली LC3B (गहरे नीले रंग में चिह्नित), autophagosomal झिल्ली के एक मार्कर होते हैं, भोजी और विशाल भक्षककोशिकीय गठन के बीच एक सख्त एसोसिएशन का सुझाव दे। Gφ जीएम- CSF / आईएल 4 युक्त मध्यम में विकसित नहीं है। इसके अलावा, इस तरह के NADPH oxidase अवरोध के रूप में अवरोधकों – diphenylene iodonium (डीपीआई), भोजी अवरोधकों 3-methyladenine (3-एमए) और bafilomycin (BafA1) और phagocytosis अवरोध cytochalasin बी (। Cyto बी) अपने गठन को समाप्त। (4) विवो में संभावित Gφ कार्यों विरोधी या समर्थक भड़काऊ गुणों और atherosclerotic प्रक्रियाओं में भागीदारी (यह आंकड़ा हमारे निष्कर्ष 14, 15 पर आधारित है और बी से साथ संपादकीय से संशोधित किया गया था शामिल हो सकते हैंerton 20)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
विशालकाय फ़ैगोसाइट (Gφ) न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न कोशिकाओं ऐसे CD66b / CD15 / CD63 / MPO / पूर्वोत्तर के रूप में मौलिक और विशिष्ट neutrophilic मार्कर व्यक्त करने का एक नव परिभाषित उप-जनसंख्या कर रहे हैं। न्यूट्रोफिल व्युत्पन्न भक्षककोशिकीय के इस प्रकार के साहित्य में पहले वर्णित नहीं किया गया था। न्यूट्रोफिल कि अल्पकालिक होते हैं और apoptosis से गुजरना विपरीत, Gφ Annexin-V-नकारात्मक हैं और बढ़ाया उम्र प्रदर्शित करते हैं। फिर भी, न्यूट्रोफिल की तरह, Gφ भी कणों internalize और उन कणों को और पीएमए के जवाब में NADPH oxidase निर्भर आरओएस का उत्पादन। हालांकि, उनकी क्षमता OxLDL internalize और फलस्वरूप उत्पादन करने के लिए आरओएस Gφ की अनूठी विशेषताएं हैं। 14
कारकों की एक संख्या संस्कृति में उनके विकास को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। मध्यम विकास में बाहरी साइटोकिन्स या वृद्धि कारकों की कमी आवश्यक है (विशेष रूप से जीएम-सीएसएफ / आईएल 4)। हालांकि, आईएल -8 की ओर पलायन न्यूट्रोफिल उन है कि देव के बीच एक भेदभाव कारक साबित कर दियाGφ में भाग गई और उन है कि ऐसा नहीं किया। इसके अलावा, apoptotic न्यूट्रोफिल से उत्पन्न होने वाले मलबे के internalization, भोजी प्रोटीन (LC3B) और कार्यात्मक NADPH oxidase की अभिव्यक्ति, सभी उनके विकास के लिए जरूरी हो सकता है, के बाद से उनके निषेध Gφ गठन (चित्रा 1) को रोका दिखाया गया। जाहिर है, इन विशाल न्यूट्रोफिल से उत्पन्न होने वाली कोशिकाओं के विकास monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश में है कि निस्र्पक विशाल सेल के गठन से अलग है। विविध जीर्ण सूजन रोग, 20, 21 के साथ जुड़े बाद फार्म बहु nucleated विशाल कोशिकाओं जबकि neutrophilic Gφ यहाँ autophagocytosis के माध्यम से विकसित वर्णित है, सेल अवशेष छा द्वारा और ज्यादातर मोनो nucleated रहने के लिए अपने विकास के दौरान, 14 (शायद ही कभी लेकिन, कभी कभी एक दूसरे नाभिक मनाया जा सकता है)। इसके अलावा, नियंत्रण की एक संख्या में अपने neutrophilic मूल की स्थापना: (1) Expreविशिष्ट neutropilic मार्करों के ssion और वृक्ष के समान है और monocytic वंश मार्कर के अभाव, (2) monocytes में उनकी बाधा उत्पन्न विकास / PMN सह संस्कृतियों, (3) मैक्रोफेज (के रूप में लाइव सेल इमेजिंग और समय इसका सबूत से संस्कृति में आंदोलन की अपनी अलग पैटर्न -lapse माइक्रोस्कोपी), 14 (4) प्लास्टिक के बर्तन और (5) शुद्ध CD15 + / CD14 से उनके विकास के लिए उनके प्रकाश पालन – PMN प्रवाह cytometry द्वारा हासिल कर ली।
कार्यों में इन विट्रो पहचान से कुछ हमें विवो में अपनी क्षमता से कार्य करने के रूप में सुराग दे सकता है। एक भोजी प्रोटीन जो सहज प्रतिरक्षा संकेत दे रास्ते के साथ बातचीत के माध्यम से नियामक सूजन को कम करने के लिए योगदान देता है, 22 – – उदाहरण के लिए, Gφ की क्षमताओं न्यूट्रोफिल कणिकाओं और मलबे, बड़े रिक्तिकाएं की उपस्थिति, और अभिव्यक्ति LC3B की बड़ी मात्रा में उपभोग करने के लिए जो सभी के लिए समर्थन सफाई क्षमताओं। जैसे की, इन निष्कर्षों भी संकेत मिलता है कि Gφ भड़काऊ साइटों जहाँ Mφ / डीसी प्रणाली अपर्याप्त या अभिभूत है पर कार्य किया जा सकता है, और इस तरह सूजन के समाधान के लिए योगदान करते हैं। यह धारणा है कि इस तथ्य के मिश्रित monocyte / न्यूट्रोफिल संस्कृतियों में Gφ विकास प्रभावित होता है द्वारा समर्थित किया जा सकता है। 14 इसके अलावा, यह देखते हुए कि Gφ, oxLDL मेहतर रिसेप्टर्स (CD36, CD68) एक्सप्रेस oxLDL भली, और यह के जवाब में आरओएस उत्पादन, संकेत हो सकता है कि वे सूजन को हल करने atherosclerotic प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं। चूंकि Gφ केवल न्यूट्रोफिल जो आईएल -8 की ओर चले गए, और आईएल -8 तीव्र भड़काऊ साइट्स के लिए न्युट्रोफिल भर्ती का प्रतिनिधित्व करने की दिशा में endothelial monolayers भर न्यूट्रोफिल 'स्थानांतरगमन से विकसित की है, यह निष्कर्ष भी विरोधी भड़काऊ कार्यों का समर्थन कर सकता है। इसके विपरीत, कुछ भड़काऊ शर्तों में Gφ के प्रदर्शन को दाना घटकों और आरओएस का निर्वहन करने के लिए, इस प्रकार उन्हें सक्षम हो सकता है, प्रति के लिए योगदानsistent सूजन और ऊतकों को नुकसान। 20 हालांकि, कुल मिलाकर, उनकी क्षमताओं autophagic संकेत मिलता है कि Gφ संभावना भड़काऊ प्रतिक्रिया ह्रासमान के बजाय इसे बनाए रखने में शामिल हैं।
दिलचस्प बात यह है कि हम हाल ही में मानव atherosclerotic सजीले टुकड़े में Gφ की उपस्थिति की पहचान की है। (तैयारी में)। फिर भी, सवालों की एक बड़ी संख्या को सुलझाया जा रह है। उदाहरण के लिए, Gφ समर्थक या विरोधी भड़काऊ रहे हैं? कारक हैं जो इन विट्रो में या विवो में अपने गठन और समारोह का निर्धारण कर रहे हैं? जो विशिष्ट न्यूट्रोफिल उप-जनसंख्या उनकी अग्रदूत सेल कि Gφ में उनके विकास की सुविधा है? वे कुछ विकृतियों और जो के साथ जुड़े रहे हैं? सामूहिक रूप से, अपने मूल और संभावित कार्यों के रूप में दिलचस्प सवाल प्रस्तुत।
प्रोटोकॉल के भीतर हालांकि महत्वपूर्ण कदम और नुकसान को ध्यान में रखा जाना चाहिए। Gφ मैं के विकास में एक महत्वपूर्ण कदमएस संवर्धन साइटोकिन्स, वृद्धि कारक या एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से रहित शुद्ध न्यूट्रोफिल। एक और महत्वपूर्ण कदम शासन से बाहर है कि Gφ दूषित monocytes से विकसित करने और Gφ की neutrophilic उत्पत्ति का पता लगाने के लिए है। मार्कर – इस प्रकार, असंतत ढाल से रक्त जुदाई के बाद, न्यूट्रोफिल आगे की शुद्धि के लिए एक अतिरिक्त कदम के प्रवाह से granulocyte gating और CD15 + / CD14 का उपयोग कर cytometry अधीन थे। विकसित Gφ न्यूट्रोफिल कि आगे जुदाई प्रवाह cytometry द्वारा शुद्ध कर रहे थे कि उन लोगों के शुद्धिकरण के इस कदम के अधीन नहीं किया गया से अलग नहीं किया था से प्राप्त की। इसलिए, प्रयोगों के सबसे अतिरिक्त सेल नुकसान के कारण शुद्धि के कदम प्रवाह cytometry के बिना आयोजित की गई। ध्यान से, कुछ दुर्लभ मामलों में कुछ eosinophils संस्कृति में नोट किया गया। उनके आकार संस्कृति अवधि के दौरान अपरिवर्तित रहे। हमें यह भी ध्यान रखना चाहिए कि यद्यपि वहाँ तरीकों में से एक नंबर रहे हैंमानव रक्त से न्यूट्रोफिल अलग होने के लिए, विधि यहाँ वर्णित केवल विधि हम कार्यरत है और इसलिए हम न्युट्रोफिल जुदाई के लिए उपलब्ध अन्य तरीकों से Gφ विकास की तुलना नहीं कर सकते हैं।
Gφ की जांच में एक प्रमुख ख़तरा विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए उपयुक्त शुद्ध Gφ आबादी के लिए पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए अक्षमता का परिणाम है। यह स्थिति हमारे प्रयोगों का आयोजन किया गया में मूल रूप से असंभव है। सबसे पहले, Gφ की उपज कम है। 1.0 x 10 6 से PMN वरीयता प्राप्त लगभग 100 – 200 से Gφ संस्कृति में सात दिनों के बाद विकसित करने, रक्त दाता पर निर्भर करता है। दूसरा, यह पल डिश में शेष न्यूट्रोफिल मलबे से संस्कृति में विकसित Gφ को अलग करने पर मूल रूप से मुश्किल है। इन सीमाओं यह व्यावहारिक रूप से असंभव जैव रासायनिक या आणविक जीव विज्ञान के तरीकों द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए बनाया है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के प्रकाश का उपयोग करके Gφ पहचान और समारोह का वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया हैऔर confocal माइक्रोस्कोपी। उनके रूपात्मक संस्कृति में Gφ में न्यूट्रोफिल से परिवर्तन भी लाइव सेल इमेजिंग और समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया। 14 जाहिर है, बहुत बड़ा रक्त की मात्रा में जैव रासायनिक या आणविक जीव विज्ञान के तरीकों को लागू करने और कम उपज प्राप्त काबू पाने के लिए आदेश और डिश में न्यूट्रोफिल 'मलबे से व्यवहार्य Gφ को अलग करने में जरूरत हो सकती है।
सारांश में, हम हाल ही में पहली बार के लिए Gφ के विकास संस्कृति में, का वर्णन किया है neutrophilic मूल के लंबे समय रहते फ़ैगोसाइट की एक उप-जनसंख्या। (Gφ की कम उपज संस्कृति में प्राप्त की और अक्षमता संस्कृति में न्यूट्रोफिल मलबे से विकसित Gφ अलग करने के लिए इसलिए, यह केवल विधि वर्तमान संस्कृति में Gφ प्राप्त करने के लिए उपलब्ध है, हालांकि दो प्रमुख सीमाओं से ऊपर उल्लेख दूर किया जाना चाहिए पकवान)। फिर भी, उनकी तैयारी और पहचान, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया, आवश्यक तत्व हैआदेश में आगे संभावित महत्व और Gφ के कार्यों की जांच करने में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और न्युट्रोफिल जीव विज्ञान और plasticity में रुचि है, वैज्ञानिकों के लिए एल।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों confocal माइक्रोस्कोपी पढ़ाई के साथ उसकी अमूल्य मदद के लिए डॉ एडिथ सुश-टोबी धन्यवाद। इस अध्ययन Kamea कार्यक्रम (एलडी और एपी) के ढांचे के तहत आव्रजन अवशोषण के मंत्रालय और योजना के लिए समिति और उच्च शिक्षा के लिए परिषद के बजट से समर्थन किया था। हम भी आभार लेडी डेविस फाउंडेशन पोस्ट-डॉक्टरल रिसर्च फैलोशिप से रिसर्च फेलो (या) के समर्थन स्वीकार करते हैं।
Sterile scalp vein set (21GX3/4) | Bio Diagnostics Ltd. | # 20080312 | A strile needle for venipancture |
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP | Greiner Bio-One | # 450263 | For securing during venipuncture |
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16×100/9 ml) | Greiner Bio-One | # 455036 | Sterile tube for blood collection |
Nunclon MultiDish (24 wellx1ml) | Thermo Scientific | # 142475 | |
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml) | Greiner Bio-One | # E14103PJ | |
Transwell-24 well (transmigration assay) | Corning | # CA-3415 | Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores) |
RPMI-1640 medium | BioIndustries | # 01-100-1A | Do not add antibiotics |
EA.hy926 (ATCC CRL2922) | BioIndustries | # CRL-2922 | |
ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | BioIndustries | # 302002 | complete growth medium |
Polysucrose – Histopaque1119 | Sigma-Aldrich | # 1119-1 | Tissue culture grade |
Polysucrose – Histopaque1077 | Sigma-Aldrich | # 1077-1 | Tissue culture grade |
Phosphate buffered saline (PBS) – ion free | BioIndustries | # 02-023-1A | Cell biology and molecular biology grade |
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS) | BioIndustries | # 04-121-1B | Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS |
NaCl | Sigma | # S3014 | Molecular biology grade, suitable for cell culture |
Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | # 15710 | Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA) |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | # 9002-93-1 | Molecular biology grade |
Normal Goat Serum | BioIndustries | # 04-009-1 | Cell biology and molecular biology grade |
Trypan blue | BioIndustries | # 031021B | Tissue culture grade |
May-Grünwald | Sigma-Aldrich | # MG500 | Cell biology grade-(procedure No GS-10) |
Giemsa stain Kit | Sigma | # 48900 | Cell biololgy grade-(procedure No GS-10) |
Fibronectin | BioIndustries | # 03090105 | |
Human Interleukin-8 (CXCL8) | PeproTech | # 200-08-5 | |
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-58951 | Mouse IgG2b; expressed by monocytes |
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-5275 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
Anti-CD66b (clone 80H3) | AbD Serotec | # MCA216 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-090-695 | Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells |
Anti-CD15 (clone MY-1) | Abcam | # ab754 | Mouse IgM; expressed by neutrophils |
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1) | BioLegend | # 650001 | Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex |
Anti-CD68 | Protein Tech | # 16192-1-AP | Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor |
Anti-LC3B | Sigma | # L7543 | Rabbit IgG |
Anti-Myeloperoxidase | Abcam | # ab45977 | Rabbit IgG |
Anti-Neutrophil elastase | Calbiochem | # 481001 | Rabbit IgG |
Anti-NOX2 (gp91-phox) | Abcam | # ab131083 | Rabbit IgG |
Anti-CD36 (SR-B3) | Novus Biologicals | # NB400-144 | Rabbit IgG |
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45) | BioLegend | # 401401 | Antibody used as isotype control |
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173) | BioLegend | # 400263 | Antibody used as isotype control |
Normal rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-2027 | Antibody used as isotype control |
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20012 | Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A |
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20043 | Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647 |
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20010 | Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A |
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20040 | Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647 |
Fluorescent Mounting Medium with DAPI | Vectashield H-1000; Vector Lab Inc. | # E19-18 | Nuclear staining |
Confocal laser scanning microscope (LSM 700) | Carl Zeiss | Ser.# 3523000380 | Plan Apo x40 immersion oil objective |
Zeiss CLSM software (ZEN 2010) | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 6.0 | For colocalization analysis |
ImageJ software | Wayne Rasband, NIH, USA | version 1.49k | For determination of cell areas and fluorescence intensity |
Light microscope (Axiovert 25) | Carl Zeiss | Ser.# 201060153 | Examination of cells in culture |
Centrifuge (Megafuge 1.0 R) | Heraeus Instruments | # D-37520 | Cells separation from blood; cytospins preparation |
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1) | Carl Zeiss | Ser.# 3834001470 | Demonstration of giant phagocytes development |
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box) | Life Imaging Services | Temperature control system for microscopes | |
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm) | Carl Zeiss | Ser.# 117090279 | For capturing high-contrast image data from an examined cell objects |