Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
在新生儿期中风是死亡和残疾的显著原因,在多达100 2300个活产1的发生。这导致改变中枢神经系统发育,提高长期的发病率,包括增加癫痫的发生,脑瘫,智力低下,以及其他类型的运动或认知功能障碍。早期中风的终身影响使平移动物模型研究在这一人群中损伤修复的机制,包括战略,以保护脑损伤或提高维修是必不可少的。
不同的缺血模型已被用于研究成年动物的脑损伤,并且在2过程通常用来研究在发育中的大脑缺氧缺血性损伤稻万努奇(修改莱文),局灶性脑缺血再灌注损伤的独特的机制引起局灶性损伤,具有损伤的核心和penuMBRA和未受伤的远程组织。小泉3和龙格4模型,在成年大鼠分别开发经颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)来实现短暂大脑中动脉闭塞。在这两种模式,永久结扎动脉分支的烧灼是很重要的,尽量减少出血和简化手术过程,这也导致对动物的能力,饲料和发胖损伤后的不良影响。此外,存在于未成熟的脑损伤不同机制和视为结果损伤的特定图案。
最近,光化学中风(玫瑰孟加拉法)5和永久性MCA结扎6已经被用于研究新生儿和成人中风。无论光化学中风和MCA结扎创建脑血流量导致缺乏reperfus的永久性变化离子。再灌注是病灶性损伤的发生和发展的一个重要组成部分,具有增加的兴奋性中毒,自由基形成,和一氧化氮的产生,导致其涉及的信令是从缺血阶段7不同级联延迟细胞死亡。缺氧缺血包括永久性单侧颈总动脉结扎后跟全球缺氧,这也不同于缺氧缺血性损伤的原因在人类和不引起一致的局灶性损伤模式,使受伤的核心和半影更具挑战性的研究。
使用短暂大脑中动脉闭塞(MCAO)8,9,10我们先前已经描述的非出血性缺血再灌注性中风模型中的未成熟的大鼠。这是访问和通过没有永久ligati颈内动脉闭塞MCA较小侵入性方法或烧灼。这提供了损伤的类似行程的在围产期11,12的最常见原因的模型。在同侧纹状体和parieto,颞叶皮层损伤损伤导致的这种缺血再灌注模型。 tMCAO的该模型还允许通过改变闭塞的持续时间而造成的伤害的严重程度的控制。信号通路,并在受伤的核心和半影和未受伤的同侧和对侧组织学变化的检查可以进一步阐明在未成熟脑损伤和修复的机制。这项研究将展示发育中的大脑这个重要的损伤模型。
在协议中的关键步骤
首先,要保持从麻醉开始正常体温,直到完全恢复是非常重要的,因为已知在未成熟和成熟的动物都低温17热疗18脑损伤的进展的效果。其次,在确保动物和回缩切口,最佳定位监测呼吸,以确保气管是免费的压缩是必不可少的。三,避免挤压或拉伸的迷走神经,因为这可能会导致心脏率与迷走神经刺激的变化。第四,由于ICA的回缩是必要的动脉切开术中控制出血,必须注意回缩期间支付给紧张程度,以避免损坏动脉。如果动脉并从回缩撕裂,或者如果有一个贫穷的动脉切开切口,动物应该从分析中排除由于风险出血和再灌注不良。
修改和故障排除
使用MRI作为指导,缝线长度可被优化以确保该硅酮尖端正确地闭塞MCA创建局灶性缺血。如果MRI是不可用,幼崽可能会再灌注前解剖以观察缝合的位置安乐死。根据需要调整所述缝合线段。小狗重量闭塞缝线长度要求高度相关。闭塞时间可以被修改以调节损伤严重程度。
此外,缝合线的形状和长度是至关重要的。对于P10的Sprague-Dawley和Long Evans大鼠体重19-21克,10毫米插入在我们的经验的最佳长度。闭塞缝合的进一步插入可能导致MCA的穿孔。此外,在每个手术闭塞灯丝的形状的一致性会导致伤害p的增加的一致性attern 19,20。出于这个原因,我们建议使用专业制造的缝合线为这一特定目的。同样重要的是要注意的是,受伤的图案可以从业者之间由于技术看似微小的差异有所不同。
该技术的局限性
表演在一个小本技术,开发啮齿动物需要显著的经验。如果正确执行,外科医生能够使不同规模的动物一个非常一致的损伤模式,达到一个存活率大于95%。此外,适当的手术工具是必不可少的。手术器械必须严格控制,以确保所有的仪器尖端接近正常。
相对于现有的或可供选择的方法这种技术的显着性
而缺氧缺血,或稻万努奇模型2 </SUP>,最常用来研究发育中的大脑缺氧缺血性损伤,需要注意的是tMCAO的这种模式是不同于HI中,有局灶性缺血没有全球缺氧,随后再灌注阶段是很重要的当阻塞被移除且血流恢复。这将导致更一致的和可重复的损伤,是临床上多由翻译引起类似于足月新生儿中风看到受伤的图案。这使的局灶性损伤模式和未受伤的组织代偿反应的研究。
掌握这一技术后,未来的应用
这个模型类似于行程在人类新生儿的最常见原因,即在围产期11,21发生了瞬态闭塞性血栓。其病因尚不完全清楚,最可能是多因素,但在大多数情况下,假定ŧø从胎盘11穿过栓塞引起。此外,假定围产期中风通常出现后癫痫发作或细微的局灶性神经功能检查许多新生儿异常22。这使得使用一个一致的,平移损伤模型,以确定损伤的进展和可能的治疗策略的关键机制。
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |