P10 चूहे में नवजात स्ट्रोक के क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा मॉडल

Summary

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Abstract

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Introduction

नवजात की अवधि के दौरान स्ट्रोक मौत और विकलांगता का एक महत्वपूर्ण कारण, के रूप में कई के रूप में 1 में 2300 जीवित जन्मों ¹ में होने वाली है। इस बदले हुए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास की ओर जाता है और मिर्गी की बढ़ती हुई घटनाओं, सेरेब्रल पाल्सी, मानसिक मंदता, और मोटर या संज्ञानात्मक शिथिलता के अन्य प्रकार सहित लंबी अवधि रुग्णता, वृद्धि हुई है। जल्दी स्ट्रोक का आजीवन प्रभाव, इस जनसंख्या में चोट और मरम्मत के तंत्र की जांच घायल मस्तिष्क की रक्षा करने या मरम्मत को बढ़ाने के लिए रणनीतियों सहित के लिए अनुवादकीय पशु मॉडल आवश्यक हैं।

विभिन्न ischemia मॉडल वयस्क पशुओं में मस्तिष्क की चोट का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और जब तक चावल Vannucci (लेविन संशोधित) ² प्रक्रिया आमतौर पर विकासशील मस्तिष्क में कमी वाली इस्कीमिक चोट का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, फोकल ischemia-reperfusion चोट की एक अलग तंत्र है फोकल चोट के कारण, एक घायल कोर और penu साथmbra और रिहाई दूरदराज के ऊतक। कोइज़ुमी ³ और Longa ⁴ मॉडल, वयस्क चूहों में विकसित किए गए क्रमशः आम मन्या धमनी (सीसीए) और बाहरी मन्या धमनी (ईसीए) के माध्यम से क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा प्राप्त करने के लिए। दोनों मॉडलों में, स्थायी बंधाव और धमनी शाखाओं के दाग़ना खून बह रहा है कम से कम करने और शल्य प्रक्रिया है, जो भी जानवर के खिलाने के लिए और चोट के बाद वजन बढ़ाने के लिए क्षमता पर प्रतिकूल प्रभाव का कारण बनता है कारगर बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, अपरिपक्व दिमाग में अलग चोट तंत्र और चोट के विशिष्ट पैटर्न एक परिणाम के रूप में देखा जा सकता है।

अभी हाल ही में photothrombotic स्ट्रोक (गुलाब बंगाल विधि) ⁵ और स्थायी एमसीए बंधाव ⁶ नवजात और वयस्क स्ट्रोक अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। दोनों photothrombotic स्ट्रोक और एमसीए बंधाव मस्तिष्क रक्त प्रवाह में स्थायी परिवर्तन है कि reperfus की कमी में परिणाम बनानेआयन। Reperfusion वृद्धि excitotoxicity, मुक्त कणों गठन, और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन में देरी कोशिका मृत्यु शामिल होता है कि झरने कि इस्कीमिक चरण ⁷ से भिन्न हैं संकेत करने के लिए अग्रणी के साथ, विकास और फोकल चोट की प्रगति का एक महत्वपूर्ण घटक है। हाइपोक्सिया-ischemia स्थायी एकतरफा मन्या बंधाव वैश्विक हाइपोक्सिया, जो मनुष्यों में भी कमी वाली इस्कीमिक चोट के कारण से अलग है और एक सुसंगत फोकल चोट पैटर्न का कारण नहीं है, घायल कोर और penumbra अधिक चुनौतीपूर्ण के अध्ययन बनाने के बाद शामिल है।

हम पहले से क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) ^{8, 9, 10} का उपयोग कर अपरिपक्व चूहे में एक गैर-रक्तस्रावी ischemia-reperfusion स्ट्रोक मॉडल का वर्णन किया है। यह एक कम आक्रामक विधि तक पहुँचता है और स्थायी ligati बिना आंतरिक मन्या धमनी के माध्यम से एमसीए occludes हैपर या दाग़ना। यह प्रसवकालीन अवधि ^{11, 12} में स्ट्रोक का सबसे आम कारण के लिए इसी तरह की चोट का एक मॉडल प्रदान करता है। इप्सिलैटरल स्ट्रिएटम और parieto-अस्थायी प्रांतस्था के नुकसान में चोट परिणामों का यह ischemia-reperfusion मॉडल। tMCAO की यह मॉडल भी रोड़ा की अवधि में परिवर्तन करके चोट की गंभीरता पर नियंत्रण की अनुमति देता है। संकेत रास्ते और घायल कोर और penumbra में और रिहाई इप्सिलैटरल और प्रतिपक्षी के ऊतकों में ऊतकीय परिवर्तन की परीक्षा आगे अपरिपक्व मस्तिष्क में चोट और मरम्मत के तंत्र स्पष्ट कर सकते हैं। इस अध्ययन को विकसित करने के लिए मस्तिष्क इस महत्वपूर्ण चोट मॉडल का प्रदर्शन करेंगे।

Protocol

सभी पशु अनुसंधान कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, पशु अनुसंधान को सेन फ्रांसिस्को समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और देखभाल और प्रयोगशाला पशु का प्रयोग (स्वास्थ्य और मानव सेवा, प्रकाशन संख्या 85-23, 1985 अमेरिकी विदेश विभाग के लिए गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया गया था )। पशु बारीकी UCSF संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC), AAALAC द्वारा मान्यता प्राप्त की पशु चिकित्सकों द्वारा निगरानी कर रहे थे। एक महिला एक 8 दिन पुरानी कूड़े के साथ Sprague-Dawley चूहे (कूड़े प्रति 10 पिल्ले) प्राप्त हुई थी। मां और उसके पिल्ले भोजन और पानी यथेच्छ दिया और दैनिक संवर्धन के साथ तापमान और प्रकाश नियंत्रित पशु देखभाल की सुविधा, IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार में रखा गया है, जब तक पिल्ले 10 दिन के थे। इस प्रक्रिया में उपयोग किए गए सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए autoclaved थे। साधन सुझावों की बाँझपन सर्जरी भर बनाए रखा है। 1. मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा पिल्ला और ensur वजनई है कि यह उचित वजन (19-21 ग्राम) है। 100% ओ 2 में 3% isoflurane में पिल्ला anesthetize और यह सुनिश्चित करने के लिए एक पैर चुटकी कोई जवाब नहीं है। शल्य चरण के तहत एक हीटिंग पैड के उपयोग के साथ 35.5 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच शरीर की सतह के तापमान को बनाए रखें। कंधे क्षेत्रों में टेप के साथ एक लापरवाह स्थिति में पशु को सुरक्षित करें। बाँझ कपास के फाहे का उपयोग करना, समाधान povidone आयोडीन डबल आसुत जल में 70% इथेनॉल की एक पट्टी के बाद साथ पूर्वकाल गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र झाड़ू, कुल चार के फाहे के लिए प्रत्येक समाधान के बीच बारी। स्थानीय स्तर पर योजना बनाई चीरा साइट में 0.25% Bupivacaine घुसपैठ। एक स्टिरियोस्कोप का उपयोग करना, एक मध्य रेखा आम मन्या धमनी (सीसीए) को बेनकाब करने के 5 से 7 मिमी पूर्वकाल ग्रीवा चीरा बनाने। 2-4 रिट्रैक्टर जगह गुहा खुला और धमनी उजागर रखने के लिए। आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए), पश्चकपाल धमनी (OA), और बाहरी मन्या धमनी (ईसीए) का पता लगाएँ। धमनियों दूल्हे स्पष्ट विचार प्राप्त करने के लिए। कार बनेंeful वेगस तंत्रिका को परेशान नहीं। नोट: दिखावा संचालित पिल्ले के लिए, inicision खुला छोड़ दिया जाता है और धमनियों संपर्क में हैं, जिसके बाद चीरा बंद सिलाई की जाती है। कुल संज्ञाहरण समय रोड़ा सर्जरी की है कि के बराबर है। 6-0 रेशम चोटी टांका धागे की 1.5 सेमी काटें। टांका Unbraid, एकल किस्में बाहर खींच रहा है। सुनिश्चित करें कि एकल किस्में स्वच्छ और नहीं अस्तव्यस्त हो रहे हैं। नोट: यदि आवश्यक हो, बाँझ पानी में एकल भूग्रस्त डुबकी और forcep सुझावों के साथ किनारा सौंदर्य से अस्तव्यस्त समाप्त होता है चिकना। 45 डिग्री के संदंश के साथ टांका किनारा दबाए रखते हुए, एक व्यापक चाप गति में संदंश के लिए कदम आईसीए के तहत जाना ताकि forcep सुझावों आईसीए और OA के बीच उभरते हैं। नोट: विच्छेदन अच्छी तरह से किया जाता है, तो यह चरण अपेक्षाकृत आसान हो जाएगा। आईसीए और OA छू रहे हैं, सावधान जब संदंश का उपयोग कर आईसीए अलग करने के लिए धमनियों टूटना नहीं हो। खून बह रहा होता है, तो संदंश जब तक साथ धमनी के लिए दबाव डालते हैंखून बह रहा बंद हो जाता है। एक बाँझ पट्टी के साथ रक्त को अवशोषित। कि संदंश द्वारा आयोजित किया जाता है टांका किनारा के अंत को पकड़ें और उसे खींच इतना है कि अंत का उपयोग करने के लिए आसान है। संदंश से किनारा छोड़ दें और संदंश से पीछे हटने आईसीए के तहत, कदम 1.5 (चित्रा 1 ए) में गति पीछे। आधार है, यह जहां सीसीए से अलग करती है के लिए निकटतम पर आईसीए के चारों ओर एक अस्थायी संयुक्ताक्षर टाई। नोट: यह शादी करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि किनारा कि गाँठ दूर करने के लिए खींच लिया हो जाएगा के अंत काफी लंबे समय (एक से अधिक 1 मिमी, कम से कम 3 मिमी) आसानी से संदंश के साथ समझ सुनिश्चित करते हुए है कि वहाँ एक त्याग के लिए गाँठ के दूसरे पक्ष पर टांका किनारा की उचित राशि। ध्यान से पार्श्व आईसीए वापस लेना और चीरा विपरीत दिशा में कांख क्षेत्र के पास अतिरिक्त त्वचा के लिए किनारा सुरक्षित करने के लिए एक क्लिप का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि इस retracting किनारा, पर्याप्त तना हुआ तो अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले रक्त के प्रवाह को रोकने के लिए है करने के लिएअनियंत्रित रक्तस्राव के जोखिम को कम। गौर करें कि धमनी फ्लैट और पीला है। नोट: मत ओवर-द वापस लेने पर यह आईसीए की एक आंशिक या पूर्ण आंसू पैदा कर सकता है के रूप में। त्याग सिर्फ क्लिप की ओर विपरीत पर किनारा पर खींच कर धमनीछेदन करने से पहले समायोजित किया जा सकता। इसके तहत और आईसीए के आसपास एक और unbraided टांका किनारा और पाश समझ, कदम 1.5 में के रूप में 45 ° संदंश का प्रयोग करें। स्थिति यह किनारा त्याग किनारा (चित्रा 1 बी) के लिए पार्श्व। नोट: यह कदम भी त्याग करने से पहले किया जा सकता है। त्याग की गुणवत्ता के बारे में अनिश्चित हैं, तो इस गाँठ बहुत शिथिल अगले कदम से पहले बंधा जा सकता है। बंधे और खुल संयुक्ताक्षर के बीच एक 0.2 मिमी धमनीछेदन रास्ते के मध्य में कटौती, बंधे संयुक्ताक्षर के करीब स्खलित। नोट: रक्त बंधे बंद धमनी में शेष धमनीछेदन के माध्यम से खाली हो सकता है लेकिन 5 μL अधिक नहीं होनी चाहिए। तो बनी रहती है खून बह रहा है, ध्यान से एक करने के लिए सावधानी से त्याग को बढ़ाने के लिए, त्याग किनारा खींचशून्य अत्यधिक तनाव से धमनी को नुकसान पहुँचाए। एक मीट्रिक शासक का प्रयोग, occluding टांका को मापने और reperfusion दौरान occluder को हटाने के लिए 2-3 मिमी की एक अतिरिक्त भत्ता के साथ टांका काटा। 45 डिग्री के संदंश के साथ occluder पकड़ो और सीधे संदंश का उपयोग उचित लंबाई में एक मोड़ बनाने के लिए एमसीए तक पहुँचने के लिए, उन्नति के लिए एक रोक बिंदु अंकन। नोट: मोड़ करने के लिए सिलिकॉन टिप छोर से एक 10 मिमी रोड़ा लंबाई इस वजन सीमा में P10 Sprague Dawley या लांग इवांस चूहे पिल्ले के लिए प्रयोग किया जाता है। 45 ° संदंश का प्रयोग, धमनीछेदन में सिलिकॉन लेपित नायलॉन रोड़ा टांका फ़ीड और मोड़ है कि एमसीए (चित्रा 1C) के लिए पूर्व निर्धारित दूरी के निशान के लिए टांका अग्रिम। सुनिश्चित करें कि उन्नति चिकनी महसूस करता है; तुरंत उन्नति रोक अगर प्रतिरोध महसूस किया है। उन्नति के दौरान, एक दिशा है कि सीसी / ईसीए के समानांतर है, सिर की ओर में टांका करना है। नोट: टांका उन्नत पृष्ठीय रूप, तो की ओरजानवर की रीढ़ की हड्डी है, यह pterygopalatine धमनी (पीटीए) में चला सकते हैं। प्रतिरोध उन्नति के 3-5 मिमी के बाद महसूस किया जाता है, टांका पीटीए जंक्शन मारा गया है। occluder धमनी से वापस जब तक सिलिकॉन सिर उन्नति दिशा समायोजित करने से पहले धमनीछेदन के पास है। यह पूरी तरह से धमनीछेदन से occluder दूर करने के लिए आवश्यक नहीं है। एक अस्थायी संयुक्ताक्षर बांधने, कदम 1.10 (चित्रा 1 डी) से किनारा का उपयोग करके occluder को सुरक्षित करें। प्रत्यागामी क्लिप निकालें। अस्थायी संयुक्ताक्षर के दोनों की किस्में ट्रिम ताकि गाँठ कि गाँठ दूर करने के लिए खींच लिया है किनारा सीधे संदंश के साथ काबू करने के लिए आसान है और किनारा कि गाँठ कस खींच लिया जाता है से अधिक है। ध्यान दें: इतना है कि वे बंद होने के बाद गुहा में उलझन नहीं है किस्में इतना छोटा हो कि होना चाहिए। रिट्रैक्टर निकालें और गुहा 6-0 चोटी रेशम का उपयोग कर तीन से चार बाधित टांके बनाने के लिए बंद कर दें। से पिल्ला निकालेंसंज्ञाहरण और कमरे में एयर में एक हीटिंग पैड पर रखें। पिल्ला मॉनिटर जब तक यह स्टर्नल अवलंबन बनाए रखने और सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से बांध के लिए यह लौटने से पहले ठीक हो गया करने के लिए पर्याप्त होश आ गया है। सुनिश्चित करें कि पिल्ला 35.5 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच एक शरीर की सतह के तापमान बनाए रखता है। रोड़ा के दौरान प्रसार भारित चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (DW-एमआरआई) isoflurane संज्ञाहरण के तहत चोट की उचित प्रेरण सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। चित्र 2 चल रहे इस्कीमिक चोट tMCAO 9 दौरान DW-एमआरआई द्वारा पता लगाया को दर्शाता है। नोट: प्रसार भारित स्पिन गूंज प्लानर इमेजिंग reperfusion से पहले 10-15 मिनट किया जाता है। पूरे मस्तिष्क धारावाहिक 2-मिमी मोटी कोरोनल निम्नलिखित पल्स अनुक्रम सेटिंग्स का उपयोग कर वर्गों के साथ imaged है: TR / TE = 5000/60 एमएस, 4 औसत, दृश्य के क्षेत्र = 35 मिमी, डेटा मैट्रिक्स = 128×128, प्रसार ढाल अवधि = 20 एमएस, जुदाई = 29.7 एमएस, आयाम = 70mT / मी, और बी-कारक = 1,045 एस / मिमी 2।इस तरह के मस्तिष्क में के रूप में cortical भागीदारी या असामान्य इस्कीमिक चोट, की कमी का प्रदर्शन पशु, बाहर रखा गया है। 2. Reperfusion नोट: रोड़ा स्ट्रिएटम और प्रांतस्था को शामिल चोट का मध्यम करने वाली गंभीर राशि पैदा करने के लिए 3 ज के लिए किया जाता है। लगभग 2 घंटे और एमसीए के 50 मिनट निम्नलिखित रोड़ा में 100% ओ 2 में 3% isoflurane में पिल्ला anesthetize। शल्य चरण के तहत एक हीटिंग पैड के उपयोग के साथ 35.5 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच एक शरीर की सतह के तापमान को बनाए रखें। कदम 1.16 से बाधित टांके निकालें और जंक्शन है, जो दो संयुक्ताक्षर और occluding टांका 'के अंत के द्वारा चिह्नित है का पता लगाने। नोट: शाम संचालित जानवरों प्रेरित और अवरोधित जानवरों के लिए एक बराबर समय अवधि के लिए संज्ञाहरण के तहत ही रहेंगे। चीरा एक बार फिर से खोला और बंद सिलाई की जाती है। दिखावा संचालित जानवरों के लिए, कदम 2.11 आगे बढ़ें। ध्यान से खोलसबसे पार्श्व गाँठ पहले लंबे समय तक किनारा खींच कर कदम 1.14 में बंधे। ध्यान दें: अगर वहाँ गाँठ untying में प्रतिरोध है, यह सुनिश्चित करें कि गाँठ का सही किनारा खींचा जा रहा है बंद करो। प्रतिरोध जारी है, एक बेहतर दृश्य के आवर्धन वृद्धि हुई है। , जब खोल के रूप में यह इस चरण के दौरान धमनी को नुकसान के लिए संभव है सतर्क रहें। गुहा से टांका किनारा निकालें। एमसीए रोड़ा निम्नलिखित वास्तव में 3 घंटे में धीरे-धीरे धमनी से बाहर occluding टांका वापस। कोई प्रतिरोध किया जाएगा। नोट: ज्यादातर मामलों में, वहाँ कोई खून बह रहा हो जाएगा। खून बह रहा है की एक छोटी राशि होती है, तो धमनीछेदन स्थल पर धमनी के लिए दबाव डालते हैं। संदंश का प्रयोग करें, धमनीछेदन के लिए दबाव लागू करने के लिए के रूप में अगले कदम के reperfusion के लिए आईसीए रक्त के प्रवाह को पुनर्स्थापित करता है। ध्यान से कदम 2.3 में के रूप में औसत दर्जे का गाँठ ही विधि का उपयोग खोल। शरीर से टांका किनारा निकालें और रक्तस्राव को रोकने के धमनीछेदन को एक hemostatic एजेंट लागू होते हैं। </li> सुनिश्चित करें कि खून बह रहा बंद कर दिया है। नोट: धमनी के मूल आकार और लाल रंग की वापसी की पुष्टि करता है कि आईसीए रक्त के प्रवाह को बहाल कर दिया गया। रिट्रैक्टर निकालें और 6-0 चोटी रेशम के तीन से चार बाधित टांके के साथ गुहा को बंद करें। संज्ञाहरण से पिल्ला निकालें और कमरे में एयर में एक हीटिंग पैड पर रखें। यह मॉनिटर जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल अवलंबन बनाए रखने और बांध को यह लौटने से पहले पूरी वसूली सुनिश्चित करने के लिए। सुनिश्चित करें कि पिल्ला 35.5 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच एक शरीर की सतह के तापमान बनाए रखता है। 5 दिनों के लिए दैनिक पिल्ले का निरीक्षण करें। उनके वजन Recprd और उचित उपचार के लिए बारीकी से चीरा साइटों का निरीक्षण किया। 7-14 दिनों के बाद टांके निकालें। पोस्ट-tMCAO चोट, एमआरआई से ली जा सकती है अगर 9 वांछित। नोट: पशु पहले दिन के वजन के 1 ग्राम से ऊपर खो सकते हैं लेकिन आम तौर पर वजन के हस्तक्षेप के बिना वजन हासिल है और एक समान के भीतर हो जाएगादिन में 4-5 से नियंत्रण करने के लिए टी रेंज। शायद ही कभी, एक पिल्ला मौखिक gavage की आवश्यकता होती है 2-3 दिनों के लिए फ़ीड अत्यधिक वजन कम या कठिनाई खिला हो सकता है,। P21 में चोट मज़बूती से इस तरह के rotarod या सिलेंडर पालन के रूप में ज्ञानेन्द्रिय व्यवहार परीक्षण, साथ मूल्यांकन किया जा सकता। संज्ञानात्मक परीक्षण इस तरह के उपन्यास वस्तु की पहचान या मॉरिस पानी भूलभुलैया 13 के रूप में आकलन का उपयोग कर उम्र के सप्ताह के रूप में जल्दी 4-6 के रूप में किया जा सकता है। मस्तिष्क फसल 11, 12 के लिए Euthasol की इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (50 मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा चूहों euthanize। ऊतकीय विश्लेषण आकलन करने के लिए चोट मात्रा या हस्तक्षेप के जवाब cresyl बैंगनी या एच एंड ई धुंधला (चित्रा 3) 10 के साथ किया जा सकता है।

Representative Results

tMCAO की वजह से चोट की गंभीरता दोनों रोड़ा समय और सर्जन के अनुभव पर बहुत निर्भर है। एक 90 मिनट रोड़ा अक्सर, एक हल्के चोट पैटर्न से मध्यम दर्जे की पैदा करता है, जबकि 3 घंटे एक उदारवादी करने वाली गंभीर चोट पैदा करता है। चोट की गंभीरता एमआरआई, ऊतक विज्ञान, या कम या लंबी अवधि के व्यवहार विश्लेषण सहित तरीकों, की एक किस्म के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता। चित्र 2 दर्शाता DW-एमआरआई का एक उदाहरण एक 90 मिनट रोड़ा में 75 मिनट का प्रदर्शन किया, इप्सिलैटरल गोलार्द्ध को शामिल इस्कीमिक चोट की पुष्टि। प्रसार भारित इमेजिंग इप्सिलैटरल स्ट्रिएटम और इप्सिलैटरल कॉर्टेक्स के बहुमत में प्रसार में वृद्धि हुई दर्शाता है, contralateral बदलाव के बिना, तीव्र इस्कीमिक चरण के दौरान। यह लंबे समय तक दोनों छाल से लेकर गहरे ग्रे मैटर को शामिल चोट के एक मध्यम स्तर से सम्बंधित है। में एमसीए परिणामों के रोड़ाकोशिका मृत्यु कि कम गंभीर चोट के लिए स्ट्रिएटम में शुरू होती है और लंबे समय तक रोड़ा बार और अधिक गंभीर चोट के लिए cortical और हिप्पोकैम्पस चोट बिगड़ती विकसित करता है। सर्जिकल तकनीक के अनुकूलन के दौरान इस तरह के टांका प्रविष्टि लंबाई निर्धारित करने के रूप में, एमआरआई सलाह दी जाती है, के रूप में यह रोड़ा 14, 15, 16 के दौरान उचित टांका प्लेसमेंट और सूजन और चोट प्रगति के दृश्य की पुष्टि के लिए अनुमति देता है। तो एमआरआई उपलब्ध नहीं है, एच एंड ई या cresyl वायलेट धुंधला सरल और विश्वसनीय ऊतकीय तरीकों चोट आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए कर रहे हैं और tMCAO के बाद दोनों जल्दी और देर से समय बिंदुओं पर इस्तेमाल किया जा सकता। चित्रा 3 एक 3 ज रोड़ा निम्नलिखित histopathological परीक्षा पर एक उदारवादी करने वाली गंभीर चोट पैटर्न को दर्शाता है, पुटी गठन और इप्सिलैटरल स्ट्रिएटम और प्रांतस्था में मात्रा का प्रदर्शन है। <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"> Cresyl बैंगनी से सना हुआ वर्गों contralateral hemispheric मात्रा के इप्सिलैटरल के अनुपात गणना करने के लिए निष्पक्ष stereological मात्रा इप्सिलैटरल इस्कीमिक-reperfusion चोट की पुष्टि करता है। विशेष रूप से, Euthasol साथ जानवर anesthetizing के बाद, मस्तिष्क transcardiac छिड़काव द्वारा 0.1 एम पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ काटा गया था। रात भर postfixation और 30% sucrose में संतुलन के बाद, पूरे मस्तिष्क 50 सुक्ष्ममापी अंतराल पर sectioned किया गया था, और हर बारहवें अनुभाग का चयन किया गया, घुड़सवार, और cresyl बैंगनी 10 के साथ दाग। यहां तक ​​कि हल्के चोट, इस तरह के चक्कर और hemiparesis के रूप में हरकत में परिवर्तन, साथ, रोड़ा अवधि के दौरान ध्यान दिया जाता है। अधिक गंभीर चोट के साथ, इन परिवर्तनों reperfusion के बाद बने रहेंगे। अतिरिक्त व्यवहार परीक्षण चोट की गंभीरता, rotarod या सिलेंडर ज्ञानेन्द्रिय समारोह के लिए पालन परीक्षण और के लिए मॉरिस पानी भूलभुलैया सहित आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासंज्ञानात्मक समारोह 13। चित्र 1: tMCAO प्रक्रिया लाइव सर्जिकल छवियाँ। (ए) पहले टांका किनारा के रूप में कदम 1.6 में विस्तृत, आईसीए के आसपास फंस गया है। (बी) के पहले अस्थायी संयुक्ताक्षर बंधा हुआ है और आईसीए मुकर रहा है। के रूप में कदम 1.9 में विस्तृत दूसरा टांका किनारा आईसीए के आसपास फंस जाता है, पहले टांका किनारा करने के लिए पार्श्व,। (सी) सिलिकॉन लेपित रोड़ा टांका, के रूप में कदम 1.12 में विस्तृत धमनीछेदन साइट में खिलाया जाता है। (डी) दूसरा अस्थायी संयुक्ताक्षर, के रूप में कदम 1.14 में विस्तृत जगह में occluder सुरक्षित करने के लिए जुड़ा हुआ है। स्केल बार = 1 मिमी। चित्र 2: Occl के दौरान एमआरआईusion उपयुक्त एकतरफा चोट दर्शाता है। पूर्वकाल पीछे करने के लिए, DW-एमआरआई की कोरोनल छवि स्लाइस, एक 90 मिनट रोड़ा के दौरान प्रदर्शन किया, वृद्धि की प्रसार इप्सिलैटरल गोलार्द्ध (तीर) है, जो तीव्र चरण में चल रही इस्कीमिक चोट के साथ संगत है को शामिल का प्रदर्शन। स्ट्रोक 11 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्र 3: एकतरफा चोट tMCAO निम्नलिखित 4 सप्ताह में स्ट्रिएटम और कॉर्टेक्स शामिल। पोस्टीरियर पूर्वकाल के लिए, cresyl बैंगनी से सना हुआ कोरोनल मस्तिष्क वर्गों (प्रत्येक 50 सुक्ष्ममापी) P38 जानवरों से काटा का प्रदर्शन काफी गंभीर चोट (तीर इप्सिलैटरल पुटी गठन दिखाने के लिए और cortical कम है औरस्ट्रिआटल मात्रा) P10 पर एक 3 ज tMCAO निम्नलिखित। बाईं ओर दौर छेद एक contralateral गोलार्द्ध पहचानकर्ता प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 5 मिमी। रोग 12 की तंत्रिका जीवविज्ञान से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों

सबसे पहले, यह पूरी वसूली तक संज्ञाहरण की शुरुआत होने normothermia बनाए रखने के लिए वहाँ के रूप में दोनों अपरिपक्व और विकसित पशुओं में दोनों हाइपोथर्मिया ¹⁷ और अतिताप ¹⁸ मस्तिष्क की चोट की प्रगति पर के प्रभाव में जाना जाता है के लिए महत्वपूर्ण है,। दूसरा, जबकि पशु को सुरक्षित और चीरा, इष्टतम स्थिति से मुकर जाना साँस लेने में नजर रखने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि श्वासनली संपीड़न के नि: शुल्क है आवश्यक है। तीसरा,, के रूप में यह वेगस तंत्रिका संबंधी उत्तेजना के साथ दिल की दर में बदलाव आ सकते फैलाएंगे या वेगस तंत्रिका खींच से बचें। चौथा, क्योंकि आईसीए का त्याग धमनीछेदन दौरान खून बह रहा नियंत्रण के लिए आवश्यक है, ध्यान तनाव की डिग्री करने के लिए त्याग के दौरान धमनी को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। धमनी त्याग से आंसू करता है, या अगर कोई एक गरीब धमनीछेदन चीरा है, पशु विश्लेषण से जोखिम के कारण बाहर रखा जाना चाहिएनकसीर और गरीब reperfusion की।

संशोधन और समस्या निवारण

एक गाइड के रूप एमआरआई का प्रयोग, टांका लंबाई सुनिश्चित करने के लिए है कि सिलिकॉन टिप ठीक से फोकल ischemia बनाने के लिए एमसीए occludes अनुकूलित किया जा सकता है। तो एमआरआई उपलब्ध नहीं है, पिल्ले विच्छेदन टांका की नियुक्ति कल्पना करने के लिए के लिए reperfusion से पहले euthanized जा सकता है। आवश्यकतानुसार टांका लंबाई को समायोजित करें। पिल्ला वजन अत्यधिक occluding टांका लंबाई आवश्यकताओं के साथ संबद्ध है। रोड़ा समय चोट की गंभीरता की डिग्री को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

इसके अलावा, टांका आकार और लंबाई महत्वपूर्ण हैं। P10 Sprague-Dawley और लंबी इवांस 19-21 ग्राम वजन चूहों के लिए, 10 मिमी हमारे अनुभव में प्रविष्टि के इष्टतम लंबाई है। occluding टांका के आगे प्रविष्टि एमसीए के छिद्र में हो सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक सर्जरी में occluding रेशा के आकार में स्थिरता चोट पी की एक बढ़ा स्थिरता में परिणाम होगाattern ^{19, 20।} इस कारण से, हम इस विशेष उद्देश्य के लिए पेशेवर निर्मित टांके का उपयोग कर की सिफारिश की। यह भी ध्यान रखें कि चोट पैटर्न तकनीक में उचित रूप में मिनट मतभेद के कारण चिकित्सकों के बीच भिन्न हो सकती है महत्वपूर्ण है।

तकनीक की सीमाएं

एक छोटी सी में इस तकनीक प्रदर्शन, कृंतक विकासशील महत्वपूर्ण अनुभव की आवश्यकता है। सही ढंग से प्रदर्शन किया, सर्जन विभिन्न आकार के जानवरों के पार एक बहुत संगत चोट पैटर्न के कारण और 95% से अधिक एक जीवित रहने की दर प्राप्त करने के लिए सक्षम है। इसके अलावा, उचित शल्य उपकरण आवश्यक हैं। शल्य चिकित्सा उपकरणों में अच्छी तरह से यह सुनिश्चित करें कि सभी साधन सुझावों ठीक से अनुमानित बनाए रखा जाना चाहिए।

मौजूदा या वैकल्पिक तरीकों के संबंध में इस तकनीक का महत्व

जबकि हाइपोक्सिया-ischemia, या चावल Vannucci मॉडल ² </sup>, है सबसे अधिक इस्तेमाल किया करने के लिए अध्ययन की कमी वाली इस्कीमिक चोट में विकास मस्तिष्क, यह महत्वपूर्ण करने के लिए ध्यान दें कि इस मॉडल की tMCAO है अलग से HI में है कि वहाँ है क्षणिक फोकल ischemia के बिना वैश्विक हाइपोक्सिया का पालन करके एक reperfusion चरण है जब बाधा हटा दिया जाता है और रक्त प्रवाह को बहाल है। यह एक अधिक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट के कारण और अधिक चिकित्सकीय अनुवादकीय एक चोट पैटर्न पूर्ण अवधि के नवजात स्ट्रोक में देखा के समान है जिसके कारण है। इस फोकल चोट पैटर्न और रिहाई के ऊतकों में प्रतिपूरक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन सक्षम बनाता है।

इस तकनीक का माहिर के बाद भविष्य अनुप्रयोगों

यह मॉडल मानव नवजात शिशुओं में स्ट्रोक का सबसे आम कारण, एक क्षणिक पूर्णावरोधक थक्का कि प्रसवकालीन अवधि ^{11, 21} के दौरान होता है के समान है। एटियलजि पूरी तरह स्पष्ट नहीं है और सबसे अधिक संभावना बहुघटकीय है, लेकिन यह ज्यादातर मामलों टी में माना जाता हैओ एम्बोली नाल ¹¹ से गुजर से परिणाम। इसके अलावा, माना प्रसवकालीन स्ट्रोक अक्सर बाद में जब्ती गतिविधि या सूक्ष्म फोकल न्यूरोलॉजिकल परीक्षा के साथ वर्तमान के साथ कई नवजात शिशुओं ²² असामान्यताएं। यह एक सुसंगत, अनुवादकीय चोट मॉडल का उपयोग चोट प्रगति और संभव चिकित्सकीय रणनीति महत्वपूर्ण के तंत्र की पहचान करने में आता है।

Materials

Isoflourane	Henry Schein	50033	anesthetic, at 3%
Trinocular Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
Heating pad	Sunbeam	000731-500-000	low to medium setting
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Retraction kit for small animals	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	112522-00	2x
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35	2x
B-2 Micro Clamp	Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm cutting edge
Occlusion Sutures	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Ruler	Fine Science Tools
Hemostatic Agent	Avitene	DVL1010590
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 ml/kg
Cotton Tipped Applicators	Henry Schein	100-9249
Laboratory Tape	VWR	89097-990