Meting van differentieel gemethyleerde<em> INS</em> DNA-Species in monsters humaan serum als een Biomarker van Islet β Cell Death
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
Type 1 diabetes (T1D) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door de vernietiging van insuline producerende eilandjes β cellen door autoreactieve T-cellen 1. De diagnose van type 1 wordt gewoonlijk plaats na meting van hyperglycemie (bloedglucose> 200 mg / dl) in een slanke jonge individu, dat met ketoacidose zou voorstellen als bewijs van insulinedeficiëntie. Ten tijde van de diagnose van type 1, blijken er aanzienlijk verlies van β celfunctie en massa (50-90%) 2. In klinische studies, verschillende immuun modulerende geneesmiddelen die op het ogenblik van de diagnose werd ingesteld resulteerde in de stabilisatie van β celfunctie (en vermoedelijk massa), maar niets hebben geleid tot klinische remissie van de ziekte, een bevinding dat de oproep voor de ontwikkeling heeft verhoogd van biomerkers voor vroege detectie van de ziekte en de lengterichting volgen van de effectiviteit van combinatietherapieën 3,4. Inspanningen van internationale consortia, zoals eenis de Human Islet Research Network Consortium bij de National Institutes of Heath 5, hebben benadrukt de noodzaak om biomarkers die zich richten op β cel stress en dood in T1D ontwikkelen.
9 – In lijn met deze inspanningen, hebben onze groep en anderen onlangs biomarkeranalyses Deze maatregel circuleren, epigenetisch gemodificeerd DNA fragmenten die in de eerste plaats het gevolg zijn van stervende cellen β 6 ontwikkeld. In alle gepubliceerde onderzoeken tot nu toe heeft de nadruk gelegd op de kwantificering van het menselijk gen dat codeert voor prepro (INS), die een grotere mate van ongemethyleerde CpG posities in de coderende en promotergebieden vergelijking met andere celtypen blijkt. De bevrijding van niet-gemethyleerd INS DNA-fragmenten werd de hypothese als in de eerste plaats als gevolg van het sterven (necrotische, apoptotische) β-cellen. Onze recente studies is gebleken dat in de jeugd, verhogingen in zowel niet-gemethyleerd en gemethyleerd DNA INS op positie -69 bp (ten opzichte van thij transcriptionele site en start) werden waargenomen in nieuwe-onset T1D, en samen diende als specifieke biomarkers voor deze populatie 6. Deze biomarkeranalyses omvatten de isolatie van celvrije DNA uit serum of plasma met behulp commerciële kits rotatie, gevolgd door een bisulfiet omzetting van het geïsoleerde DNA (die niet-gemethyleerde cytosines omzetten uracils, waardoor gemethyleerde cytosines intact).
In dit rapport beschrijven we de technische aspecten van het serum monstername, isolatie van cel-vrij DNA uit serum, bisulfiet conversie, en de prestaties van de druppel digitale PCR (voortaan digitaal PCR) voor het differentieel gemethyleerd INS DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Methylering van cytosinen van DNA-methyltransferase maakt de epigenetische controle van transcriptie van veel genen. De INS-gen bij de mens is bijna uitsluitend tot expressie gebracht in eilandje β-cellen, en er lijkt een correlatie tussen de frequentie van methylering van cytosines in de INS gen silencing van de 11 transcriptie. Als zodanig, de meeste celtypen hebben substantieel hogere frequenties van methylatie van de INS-gen bij verschillende cytosines vergelijking met cellen P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
Riferimenti
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
