Procédures chirurgicales et méthodologie pour un modèle murin préclinique de<em> De Novo</em> Métastase du cancer mammaire

Summary

Les modèles précliniques évaluant la thérapie adjuvante ciblant les métastases du cancer du sein sont insuffisants. Pour remédier à cela, nous avons développé un modèle murin de métastases de l'adénocarcinome mammaire pulmonaire de novo , dans lequel les thérapies administrées dans le milieu adjuvant (résection post-chirurgicale des tumeurs primaires) peuvent être évaluées en fonction de l'impact sur les métastases pulmonaires préalablement ensemencées.

Abstract

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introduction

Les femmes en Amérique du Nord ont un risque de croissance de cancer du sein de ~ 12% à vie ² ; La plupart de ces personnes auront des tumeurs primaires éliminées par voie chirurgicale, et selon le sous-type de cancer, recevront alors une thérapie ciblée, endocrinienne, chimiothérapie et / ou radiologique dans le cadre adjuvant ³ . Les exemples incluent les femmes diagnostiquées avec des cancers positifs aux récepteurs hormonaux recevant des thérapies anti-oestrogènes et des femmes atteintes de tumeurs positives à l'HER2 recevant des thérapies ciblées par HER2 avec radiothérapie / chimiothérapie, alors qu'aucune thérapie ciblée n'est encore disponible pour les tumeurs négatives ³ . Malgré les progrès dans les traitements radiologiques, de chimiothérapie, personnalisés et hormonaux qui complètent la résection chirurgicale, la maladie se retrouve chez 30 à 70% des femmes diagnostiquées avec une maladie de stade II ou III ⁴ , car les thérapies sont largement inefficaces dans l'élimination de la maladie métastatique dans les organes distants, y compris Poumon, os, bPluie et / ou foie ⁵ . Ceci est particulièrement important étant donné que lorsque la maladie métastatique se produit en l'absence de repousse tumorale primaire, cela implique que les cellules malignes disséminées étaient probablement déjà présentes dans les organes secondaires au moment de la chirurgie définitive. Ainsi, les traitements capables d'éradiquer ou de ralentir la croissance des tumeurs métastatiques sont nécessaires de toute urgence.

Alors que les modèles de souris de nouveau de la carcinogenèse mammaire ont été remarquablement informatifs dans les mécanismes révélateurs régissant la progression néoplasique ¹ , les modèles existants ont également plusieurs limites. L'un d'entre eux est le fait que les modèles transgéniques de novo développent généralement des tumeurs primaires dans de multiples glandes mammaires, dans lesquelles le fardeau tumoral primaire limite la durée des études. Bien que l'évasion de cellules tumorales primaires et l'ensemencement métastatique se produisent probablement au début de la progression néoplasique dans ces modèles, le développement franche de tumeurs métastatiques se produit tardivement et en fonction deN le modèle de la souris et le fond de la déformation, est souvent partiellement pénétrant ¹ . Cela limite encore l'utilité des modèles de novo pour la découverte de molécules régulant les métastases dans les organes secondaires et pour évaluer l'efficacité préclinique de la thérapeutique dans le milieu adjuvant.

Pour contourner ces limites, nous avons développé un modèle autochtone nouveau de métastase de carcinome mammaire dans les poumons. Femelles transgéniques parentales (c. -à- MMTV-PyMT sur le FVB / N fond de contrainte pour les études décrites ici) portant un stade avancé de novo des tumeurs mammaires sont vieillis à environ 100 jours ^6, à quel point les tumeurs primaires sont chirurgicalement réséquées et enzymatiquement dissociées en Suspensions cellulaires simples. Les suspensions (1 x 10 ⁶ cellules) sont à leur tour expliquées orthotopiquement chez des souris femelles syngéniques réceptrices de 6-7 semaines, où des tumeurs mammaires primaires primaires se développent sur une période de 38 à 60 jours ( <stronG class = "xfig"> Figure 1A). À une taille de tumeur définie (172 à 450 mm ³ ), les souris destinataires sont anesthésiées et les tumeurs primaires sont résistées chirurgicalement de sorte que la repousse de la tumeur au site chirurgical est minimisée, conformément à la chirurgie chez les femmes ( Figure complémentaire 1 ). Sur le fond de la souche FVB / n, les souris développent des foyers métastatiques histologiquement détectables dans les poumons avec une pénétrance de 45% par ~ 115 jours après la chirurgie ( figure 1B ). Avec cette latence prolongée de la croissance tumorale métastatique, le modèle est idéalement positionné pour la distribution de la thérapie adjuvante et pour élucider et évaluer la biologie sous-jacente influençant la progression métastatique suite à l'élimination chirurgicale des tumeurs primaires.

Protocol

Les animaux utilisés dans le protocole suivant sont couverts par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Oregon Health & Science (IACUC), qui est conçu pour être conforme aux règlements de la Loi sur le bien-être animal et à la Politique sur le service de santé publique (PHS). Entretien des conditions stériles: les instruments stérilisés doivent être utilisés et entre les souris doivent être nettoyés avec de la gaze stér…

Representative Results

Plus de 75% des souris recevant 1 x 10 6 cellules provenant de tumeurs mammaires primaires dérivées de souris MMTV-PyMT, développent des adénocarcinomes mammaires simples allant de 172 à 450 mm 3 dans les 38 à 60 jours (données non présentées). Les souris admissibles à la randomisation sont ensuite inscrites dans les groupes d'étude suite à la résection chirurgicale des tumeurs primaires, comme indiqué ( Figure 1C ). L…

Discussion

Modifications et dépannage:

Lorsqu'une tumeur disséquante qui se dissout loin de la paroi abdominale, la tumeur peut rester adhérente à la paroi abdominale. Ceci a été observé chez <5% de souris injectées avec une tumeur (données non présentées). Pour les souris atteintes de tumeurs adhérentes à la paroi abdominale, la souris doit être euthanasiée car la résection est difficile sans repousse primaire de la tumeur.

L…

Materials

Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800