Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
De overdracht van genen en eiwitten op micro-niveau organismaal speelt een centrale rol in bacteriële overleving en ontwikkeling en ontstekingsprocessen. De uitwisseling van DNA tussen bacteriën of tussen een bacterie en een cel kan worden bereikt door transformatie, conjugatie of transductie vector. 1,2 Conjugatie is uniek in vergelijking met transformatie en transductie dat tijdens conjugatie tussen gram-negatieve bacteriën zoals Escherichia coli, de overdracht van DNA optreedt in een donor-gecontroleerde wijze waardoor een complexe macromoleculaire verbindt donor en ontvangende cellen. Conjugatie is de meest directe manier waarop bacteriële cellen interageren met gastheercellen genen, eiwitten of chemicaliën te injecteren om gastheersystemen. 3 Heel vaak, de overdracht van dergelijke middelen heeft opmerkelijke effect op de host, variërend van pathogenese en carcinogenese aan de evolutie en adaptatie te organiseren. Het is aangetoond dat conjugatie recombination verhoogt de snelheid van de aanpassing 3-voudig in bacteriën met een hoge mutatie tarieven onder de omstandigheden van het milieu stress. 4 Bovendien conjugatie is veruit de meest voorkomende waarlangs antibiotische resistentiegenen in bacteriële stammen worden verspreid. 5,6
Micro-organismen hebben gespecialiseerde secretie systemen ontwikkeld om de overdracht van macromoleculen over cellulaire membranen te ondersteunen; Er zijn 9 typen secretie systemen (TSSS) in gramnegatieve bacteriën die zijn beschreven T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, evenals de Sec (secretie) en Tat (twee-arginine translocatie) trajecten. 7,8 Elk type secretie systeem is verder onderverdeeld in verschillende subtypen, noodzakelijk vanwege de diversiteit van eiwitten en het onderscheidend vermogen van paden betrokken bij verschillende bacteriële stammen. Bijvoorbeeld in de type IV secretie systeem (T4SS), de Ti en Cag systemen effector transport dat het F-plasmide te vergemakkelijken, R27 eennd pKM101 T4SSs vergemakkelijken overdracht van een conjugatie plasmide. 7,9,10 Een gedetailleerd inzicht in de mechanismen die organismen assembleren hun afscheiding systemen uit hun component eiwitten en deel cellulaire inhoud met een ontvanger of hun omgeving is een belangrijke factor in de ontwikkeling van gerichte strategieën om pathogene micro-organismen en de processen van de bestrijding cellulaire infectie.
Na de initiële identificatie bacterieconjugatie in E. coli door Lederberg & Tatum, 11 een groot aantal mobiele en conjugatie plasmiden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. 12 Dergelijke mobiele plasmiden vertonen grote bereik grootte (van 1 tot meer dan 200 kilobasen (kb)), maar alle mobiele plasmiden bevatten relaxase, die de oorsprong van overdracht (oriT) waardoor het mogelijk overdracht van het plasmide herkent. Conjugatie plasmiden verdere genen coderen voor de assemblage van een functioneel T4SS en een soortIV koppeling eiwit. 12 Bijvoorbeeld de 100 kb F-plasmide van E. coli codeert alle conjugative genen binnen een 33,3 kB overdracht (TRA) regio. 13 De genen in de tra regio van het F plasmide coderen alle eiwitten die pilus vorming te vergemakkelijken, paring vorming pair (MPF), DNA-overdracht en uitsluiting functies tijdens conjugatie plasmide-overdracht. 10,14,15 Een aanzienlijke hoeveelheid kennis is beschikbaar voor conjugative T4SSs echter gedetailleerde structurele studies van het conjugative eiwitten en complexen worden alleen maar meer recent beschikbaar komen. 16-28
Om een uitgebreid overzicht van de conjugatie proces samen te stellen, wordt een koppeling van gedetailleerde structurele studies naar analyses van conjugative overdracht eiwitten mutatie nodig. Dit kan worden bereikt door conjugatie paring assays. Voor de F-plasmide, elk eiwit gecodeerd in de tra regio speelt een rol in de F-gemedieerde conjugation; daarom zal de knockout / verwijdering van een genoverdracht de conjugatie capaciteit van de cel (figuur 1) af te schaffen. Terwijl kleinere mobiele plasmiden meer bijdragen standaard verwijderingsprocedures, voor groter conjugatie plasmiden zoals F, zijn gen knockouts gemakkelijker bereikt via homologe recombinatie waarbij het doelgen vervangen met één transporteren van een afzonderlijk antibioticumresistentiegen. In het huidige protocol, maken we gebruik van homologe recombinatie op een overdracht gen van belang met chlooramfenicol acetyltransferase (CAT) in de 55 kb F plasmide afgeleide pOX38-Tc vervangen; 29,30 de resulterende knockout plasmide pOX38-Tc Δgene :: Cm vergemakkelijkt weerstand tegen chlooramfenicol (Cm) in het kweekmedium. Donor cellen die pOX38-Tc Δgene :: Cm niet kunnen conjugatie DNA-overdracht / paring zoals waargenomen door middel van een paring test beïnvloeden; de paring efficiëntie van een pOX38-Tc Δgene :: Cm donor cel en een normale recipseerde zal afnemen of, vaker, worden afgeschaft. Conjugatie overdracht van de pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmide kan worden hersteld via een klein herstel plasmide de gerichte overdracht gen. Dit herstel plasmide kan één zijn die constitutieve expressie verschaft, zoals plasmide pK184 (pK184-gen), 31 of een die induceerbare expressie bepaalt dat zolang de plasmide goed richt het gen naar de juiste locatie in de cel (cytoplasma of periplasma). Bijgevolg is in de paring assays tussen deze nieuwe donor (herbergen pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-gen plasmiden) en een ontvangende cel, het koppelen efficiëntie verwacht te herstellen tot bijna die van een normale donor-ontvanger paring test. Dit systeem maakt het mogelijk om de functie van de knock-out gen sonde door het genereren van een reeks pK184-genconstructen (deleties of puntmutaties) en testen het vermogen van elke construct om de dekking capaciteit van de pOX38-Tc Δgene :: Cm herbergen herstellen donor cels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterieconjugatie werkwijze een middel waarmee bacteriën genen kunnen verspreiden verschaffen van een evolutionair voordeel voor groei in veeleisende omgevingen, zoals de verspreiding van antibioticaresistentie markers. Omdat veel van de conjugatie plasmiden zijn zo groot, 12 functionele studies op het betrokken bij assemblage van de overbrenginrichting door mutatie van doelgenen de conjugatie plasmide zelf eiwitten onhandig. De protocollen die hierin beschreven een middel waarmee men gemakkelijker het doel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door een Discovery Grant van de Raad Natuurwetenschappen & Engineering van Canada (NSERC).
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
References
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
- Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
- Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
- Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).
