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Genetica

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

Published: January 04, 2017
doi:
10.3791/54854
, , , , ,
1Department of Chemistry,York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions,York University

Summary

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Abstract

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Introduction

Die Übertragung von Genen und Proteinen auf der Mikro-Ebene organismal spielt eine zentrale Rolle bei der bakteriellen Überleben und die Entwicklung sowie Infektionsprozessen. Der Austausch von DNA zwischen Bakterien oder zwischen einem Bakterium und einer Zelle kann durch Transformation, Konjugation oder Vektorübertragung erreicht werden. 1,2 Konjugation im Vergleich zur Transformation und Transduktion, daß während der Konjugation zwischen gram-negative Bakterien wie Escherichia coli, der Transfer von DNA tritt in einem Spender gesteuert , wodurch eine komplexe makromolekulare System verbindet Spender- und Empfängerzellen einzigartig ist. Konjugation ist auch die direkte Weise, in der Bakterienzellen mit Wirtszellen interagieren Genen, Proteinen oder Chemikalien in zu Host-Systemen zu injizieren. 3 Oft hat die Übertragung solcher Mittel bemerkenswerte Effekte auf den Wirt, von der Pathogenese und Karzinogenese Entwicklung und Anpassung an den Host. Es hat sich gezeigt konjugativen recombination erhöht die Rate der Anpassung 3fache in Bakterien mit hoher Mutationsraten unter Bedingungen von Umweltstress. Außerdem 4 ist Konjugation mit Abstand die häufigste Weg , durch die Antibiotika – Resistenzgene in Bakterienstämme verteilt sind. 5,6

Mikroorganismen haben spezialisierte Sekretion Systeme entwickelt, um die Übertragung von Makromolekülen durch Zellmembranen zu unterstützen; gibt es derzeit neun Arten von Sekret Systemen (TSS) in Gram-negativen Bakterien, die beschrieben wurden: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS sowie die Sec (Sekretion) und Tat (zwei-Arginin-Translokation) Wegen. 7,8 Jede Art von Sekretionssystem ist weiter in verschiedene Subtypen unterteilt, eine Notwendigkeit aufgrund Vielfalt von Proteinen und die Unverwechselbarkeit von Wegen beteiligt sind , in verschiedenen Bakterienstämmen. Beispielsweise in dem Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), die Ti und Cag Systeme Effektor Transport während das F-Plasmid zu erleichtern, R27nd pKM101 T4SSs Übertragung eines konjugativen Plasmid erleichtern. 7,9,10 Ein detailliertes Verständnis der Mechanismen , durch die Organismen ihre jeweiligen Sekretionssysteme aus ihren Komponentenproteine montieren und zelluläre Inhalt mit einem Empfänger oder ihrer Umgebung teilen , ist ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von zielgerichteten Strategien pathogene Mikroorganismen und Verfahren zur Bekämpfung von zellulären Infektion.

Nach der anfänglichen Identifizierung bakterielle Konjugation in E. coli von Lederberg & Tatum, 11 eine große Anzahl von mobilen und konjugativen Plasmiden identifiziert und charakterisiert wurden. 12 solche mobilen Plasmide zeigen beträchtlichen Bereich Größe (von 1 bis über 200 Kilobasen (kb)), aber alle Mobil Plasmiden eine relaxase enthalten, die den Ursprung der Übertragung erkennt (oriT) wodurch eine Übertragung des Plasmids. Konjugativen Plasmiden weitere Gene kodieren für die Montage eines funktionellen T4SS sowie eine ArtIV Kopplungsprotein. 12 Zum Beispiel das 100 kb F – Plasmid von E. coli codiert alle konjugativer Gene innerhalb einer 33,3 kB – Transfer (tra) Region. 13 Die Gene im tra Region des F – Plasmid codieren alle Proteine , die Pilus – Bildung zu erleichtern, Paarung Paarbildung (MPF), DNA – Transfer und Ausschlussfunktionen während konjugativer Plasmidtransfers. 10,14,15 Ein bedeutender Körper des Wissens ist für konjugativen T4SSs verfügbar, detaillierte jedoch strukturelle Untersuchungen der konjugierende Proteine und Komplexe werden nur in jüngster Zeit verfügbar werden. 16-28

Um einen umfassenden Überblick über den konjugativen Prozess, eine Kopplung von detaillierte Strukturuntersuchungen zusammen Analysen von konjugativen Transfer Proteine ​​Mutations-erforderlich. Dies kann durch konjugativen Paarungs Assays erreicht werden. Für das F – Plasmid, jedes Protein im tra Region codiert spielt eine Rolle in der F-vermittelte conjugation; Daher wird die knockout / Löschung eines Gens , das das Übertragungs konjugativen Kapazität der Zelle (1) aufzuheben. Während kleinere mobile Plasmiden zuträglicher Standardlöschverfahren sind für größere konjugativen Plasmiden wie F, Gen-Knockout more werden leicht durch homologe Rekombination erreicht wobei das Zielgen mit einer Förder eine deutliche antibiotische Resistenzgen ersetzt. In der aktuellen Protokoll verwenden wir eine homologe Rekombination einen Transfer Gen von Interesse mit Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) in der 55-kb-F-Plasmid-Derivat pOX38-Tc zu ersetzen; 29,30 Die sich ergebende Plasmid knockout, pOX38-Tc Δgene :: Cm erleichtert Widerstand gegen die Anwesenheit von Chloramphenicol (Cm) in den Wachstumsmedien. Spenderzellen pOX38-Tc Δgene :: Cm Beherbergung sind nicht in der Lage konjugativen DNA-Transfer / Paarung zu beeinflussen, wie durch die Verwendung eines Gegen Assay beobachtet; die Gegenwirkungsgrad eines pOX38-Tc Δgene :: Cm Spenderzelle und einer normalen recipient wird abnehmen oder, häufiger, abgeschafft werden. Konjugativen Transfer des pOX38-Tc Δgene :: Cm Plasmid kann über eine kleine Erholung Plasmid wiederhergestellt werden, um den gezielten Transfer Gen beherbergt. Diese Erholung Plasmid kann eine sein , die eine konstitutive Expression, wie Plasmid pK184 (pK184-Gen), 31 oder einer bereitstellt , die so lange induzierbare Expression bietet wie das Plasmid richtig , das Gen an die richtige Stelle innerhalb der Zelle (Zytoplasma oder Periplasma) zum Ziel hat . Folglich ist in Paarungs Assays zwischen dieser neuen Spender (Beherbergung pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-Gen-Plasmide) und eine Empfängerzelle ist die Paarungseffizienz zu erwarten nahezu die eines normalen Spender-Empfänger-Paarung Assay wiederherzustellen. Dieses System ermöglicht es, die Funktion des ausgeknockt Gens durch die Erzeugung einer Reihe von pK184-Genkonstrukte (Deletionen oder Punktmutationen) zu sondieren und jedes Konstrukt Fähigkeit Testen der Paarungsfähigkeit des pOX38-Tc Δgene :: Cm Beherbergen wiederherzustellen Spenderzelles.

Protocol

1. Erzeugung von DNA-Konstrukten Entwerfen Oligomers für die homologe Rekombination des Zielgens Entwerfen Sie ein einzelnes 55-72 bp vorwärts Oligomer wie folgt: (a) wählen Sie eine 19-32 bp lange Nukleotidsequenz, die zu einer DNA-Sequenz in der Region 10-100 bp homolog ist stromaufwärts des 5'-Startstelle des Chloramphenicolacetyltransferasegen im Gewerbe pBAD33 Plasmid, 32 und (b) wählen Sie eine 36-54 bp lange Nukleotidsequenz homolog zu eine…

Representative Results

Der Prozess des F – Plasmid-driven bakterielle Konjugation ist ein koordinierter Prozess, der Transferproteine innerhalb des tra Region des F-Plasmids umfasst , das eine T4SS assembliert Pilus – Synthese und DNA konjugativen Transfer zu erleichtern. Das Protein TRAF (GenBank accession # BAA97961; UniProt ID P14497) für die konjugierende F-Pilus Bildung erforderlich. 10,14,35 – 37 Das Protein enthält eine C-terminale Thioredoxin-ähnliche Domän…

Discussion

Bakterielle Konjugation Verfahren liefert ein Mittel, mit dem Bakterien-Gene bietet einen evolutionären Vorteil für das Wachstum in anspruchsvollen Umgebungen, wie die Ausbreitung von Antibiotika-Resistenzmarker ausbreiten kann. Da viele der konjugativen Plasmiden so groß sind, 12 funktionelle Studien über die beteiligten Proteine in der Montage der Übertragungsvorrichtung durch Mutation von Zielgenen auf dem konjugativen Plasmid selbst sind unhandlich. Die detaillierten Protokolle hierin ein Mittel bere…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von einem Discovery-Stipendium der Naturwissenschaften & Engineering Council of Canada (NSERC) unterstützt.

Materials

GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit Fisher Scientific K0503
GeneJet Gel Extraction Kit Fisher Scientific K0692
GeneJet PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S
Broad Range DNA Ladder New England Biolabs N0303A
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713
Electroporator Eppendorf 4309000027
Electroporation cuvettes Fisher Scientific FB101 Cuvettes have a 1 mm gap.
Enzymes
AvaI New England Biolabs R0152S
EcoRI New England Biolabs R0101S
HindIII New England Biolabs R0104L
NdeI New England Biolabs R0111S
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
DpnI New England Biolabs R0176S
Antibiotics Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100 20 µg/mL
Kanamycin (Km) BioBasic Inc. DB0286 50 µg/mL
Nalidixic acid (Nal) Sigma-Aldrich N8878-25G 10 µg/mL
Rifampicin (Rif) Calbiochem 557303 20 µg/mL
Tetracycline (Tc) Fisher Scientific BP912-100 10 µg/mL
Streptomycin (Sm) Fisher Scientific BP910-50 50 µg/mL
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Riferimenti

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Erdogan, F., Lento, C., Yaseen, A., Nowroozi-Dayeni, R., Kheyson, S., Audette, G. F. Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (119), e54854, doi:10.3791/54854 (2017).
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