बैक्टीरियल संयुग्मन में शामिल स्थानांतरण प्रोटीन के अनुक्रम विशिष्ट विश्लेषण के लिए संयुग्मी संभोग Assays
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
सूक्ष्म जीवधारी स्तर पर जीन और प्रोटीन के हस्तांतरण बैक्टीरियल अस्तित्व और विकास के रूप में अच्छी तरह से संक्रमण की प्रक्रिया में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। बैक्टीरिया के बीच या एक जीवाणु और एक सेल के बीच डीएनए के आदान-परिवर्तन, विकार या वेक्टर पारगमन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। 1,2 संयुग्मन ऐसे कोलाई के रूप में ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के बीच विकार के दौरान परिवर्तन और उस में पारगमन की तुलना में अद्वितीय है, डीएनए के हस्तांतरण के एक दाता नियंत्रित फैशन जिससे एक जटिल प्रणाली macromolecular दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से जोड़ता में होता है। संयुग्मन भी सबसे सीधा रास्ता है जो बैक्टीरियल कोशिकाओं मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए मेजबान सिस्टम में जीन, प्रोटीन या रसायन इंजेक्षन है। 3 अक्सर, ऐसे एजेंटों के हस्तांतरण मेजबान पर उल्लेखनीय प्रभाव, विकास और अनुकूलन की मेजबानी करने के रोगजनन और कैंसरजनन से लेकर है। ऐसा नहीं है कि संयुग्मी recombinatio दिखाया गया हैn पर्यावरण के तनाव की शर्तों के तहत उच्च उत्परिवर्तन दर के साथ बैक्टीरिया में अनुकूलन 3 गुना की दर बढ़ जाती है। 4 इसके अलावा, विकार अब तक का सबसे आम मार्ग के माध्यम से जो जीवाणु उपभेदों में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों में फैले हुए हैं के द्वारा होता है। 5,6
सूक्ष्मजीवों सेलुलर झिल्ली भर में बड़े अणुओं के स्थानांतरण का समर्थन करने के लिए विशेष स्राव सिस्टम विकसित किया है; वर्तमान में वर्णित किया गया है कि ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में स्राव सिस्टम (TSSs) के 9 प्रकार के होते हैं: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, साथ ही धारा (स्राव) और गूंथना (दो arginine translocation) रास्ते। 7.8 स्राव प्रणाली के प्रत्येक प्रकार के आगे विभिन्न उपप्रकार में, एक आवश्यकता प्रोटीन की विविधता और शामिल रास्ते की विशिष्टता के कारण, विभिन्न जीवाणु उपभेदों में बांटा गया है। उदाहरण के लिए, प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली (T4SS) में, तिवारी और कैग सिस्टम जबकि एफ प्लाज्मिड प्रेरक परिवहन की सुविधा, R27 एकएन डी pKM101 T4SSs एक संयुग्मी प्लाज्मिड के हस्तांतरण की सुविधा। 7,9,10 तंत्र है जिसके द्वारा जीवों एक प्राप्तकर्ता या अपने आसपास के वातावरण के साथ अपने घटक प्रोटीन से उनके संबंधित स्राव सिस्टम को इकट्ठा और सेलुलर सामग्री साझा करने की एक विस्तृत समझ लक्षित रणनीतियों के विकास रोगजनक सूक्ष्मजीवों और प्रक्रियाओं का मुकाबला करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है सेलुलर संक्रमण।
Lederberg और टेटम, 11 से ई कोलाई में प्रारंभिक पहचान बैक्टीरियल विकार के बाद मोबाइल और संयुग्मी plasmids की एक बड़ी संख्या की पहचान की और विशेषता किया गया है। 12 तरह के मोबाइल plasmids दिखाने काफी रेंज आकार (1 से 200 से अधिक kilobases (केबी) करने के लिए) है, लेकिन सभी मोबाइल plasmids एक relaxase, जो हस्तांतरण (Orit) जिससे प्लाज्मिड के प्रसारण के लिए सक्षम करने के मूल पहचानता होते हैं। संयुग्मी plasmids एक कार्यात्मक T4SS की विधानसभा के लिए आगे सांकेतिक शब्दों में जीन के साथ ही एक प्रकार हैचतुर्थ युग्मन प्रोटीन। 12 उदाहरण के लिए ई कोलाई के 100 केबी एफ प्लाज्मिड एक 33.3 kB हस्तांतरण (टीआरए) क्षेत्र के भीतर सभी संयुग्मी जीन encodes। 13 संयुग्मी प्लाज्मिड स्थानांतरण के दौरान सभी प्रोटीन है कि pilus गठन की सुविधा, जोड़ी गठन (एमपीएफ), डीएनए हस्तांतरण और बहिष्कार कार्यों संभोग एफ प्लाज्मिड सांकेतिक शब्दों का टीआरए क्षेत्र में जीनों। 10,14,15 ज्ञान का एक महत्वपूर्ण शरीर संयुग्मी T4SSs के लिए उपलब्ध है, लेकिन केवल अधिक हाल ही में उपलब्ध हो रहे हैं संयुग्मी प्रोटीन और परिसरों के संरचनात्मक अध्ययन विस्तृत जानकारी दी। 16 – 28
आदेश संयुग्मी प्रक्रिया के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण को इकट्ठा करने के लिए, विस्तृत संरचनात्मक अध्ययन की एक युग्मन संयुग्मी हस्तांतरण प्रोटीन का विश्लेषण mutational करने के लिए आवश्यक है। इस संयुग्मी संभोग assays के माध्यम से हासिल किया जा सकता है। एफ प्लाज्मिड के लिए, प्रत्येक प्रोटीन टीआरए क्षेत्र के भीतर इनकोडिंग एफ की मध्यस्थता सह में एक भूमिका निभाता हैnjugation; इसलिए, पीटकर / एक हस्तांतरण के जीन का विलोपन सेल (चित्रा 1) के संयुग्मी क्षमता को समाप्त होगा। जबकि छोटे मोबाइल plasmids मानक विलोपन प्रक्रियाओं के लिए अनुकूल है, ऐसे एफ के रूप में बड़ा संयुग्मी plasmids के लिए कर रहे हैं, जीन नॉकआउट अधिक आसानी मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं, जहां लक्ष्य जीन एक एक अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन संदेश के साथ बदल दिया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम 55 केबी एफ प्लाज्मिड व्युत्पन्न pOX38-टीसी में chloramphenicol acetyltransferase (कैट) के साथ ब्याज की एक हस्तांतरण के जीन को बदलने के लिए मुताबिक़ पुनर्संयोजन को रोजगार; 29,30 परिणामी पीटकर प्लाज्मिड, pOX38-टीसी Δgene :: सेमी, विकास मीडिया में (सेमी) chloramphenicol की उपस्थिति के लिए प्रतिरोध की सुविधा। शरण pOX38-टीसी Δgene :: सेमी दाता कोशिकाओं संयुग्मी डीएनए स्थानांतरण / संभोग के रूप में एक संभोग परख के उपयोग के माध्यम से मनाया को प्रभावित करने में असमर्थ हैं; एक pOX38-टीसी Δgene :: सेमी दाता सेल के संभोग दक्षता और एक सामान्य RECIPient कमी होगी या, अधिक बार, समाप्त कर दिया जाना। pOX38-टीसी Δgene :: सेमी प्लाज्मिड के संयुग्मी हस्तांतरण लक्षित हस्तांतरण जीन को शरण देने के एक छोटे से वसूली प्लाज्मिड के माध्यम से बहाल किया जा सकता है। यह वसूली प्लाज्मिड एक है कि इस तरह के प्लाज्मिड pK184 (pK184-जीन), 31 या एक है कि इतने लंबे समय के रूप में है कि प्लाज्मिड ठीक से सेल (कोशिका द्रव्य या periplasm) के भीतर सही स्थान पर जीन लक्ष्य inducible अभिव्यक्ति प्रदान करता है के रूप में, विधान अभिव्यक्ति प्रदान करता है हो सकता है। नतीजतन, इस नए दाता के बीच संभोग assays में (pOX38-टीसी Δgene :: सेमी + pK184-जीन plasmids शरण) और एक प्राप्तकर्ता सेल, संभोग दक्षता लगभग कि एक सामान्य दाता प्राप्तकर्ता संभोग परख के लिए बहाल करने की उम्मीद है। इस प्रणाली pK184-जीन निर्माणों (विलोपन या बिंदु उत्परिवर्तन) की एक श्रृंखला की पीढ़ी के माध्यम से बाहर खटखटाया जीन के समारोह की जांच करने और प्रत्येक निर्माण के pOX38-टीसी Δgene :: मुख्यमंत्री को शरण देने का संभोग क्षमता को बहाल करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक सक्षम बनाता है दाता सेलएस।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरियल विकार प्रक्रिया एक साधन है जिसके द्वारा बैक्टीरिया ऐसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों के प्रसार के रूप में चुनौतीपूर्ण वातावरण में विकास के लिए एक विकासवादी लाभ प्रदान जीन फैल सकता है। क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद से एक डिस्कवरी अनुदान (NSERC) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
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