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Genetica

Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

Published: January 04, 2017
doi:
10.3791/54854
, , , , ,
1Department of Chemistry,York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions,York University

Summary

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Abstract

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Introduction

Il trasferimento di geni e proteine ​​a livello micro-organismal svolge un ruolo centrale nella sopravvivenza dei batteri e l'evoluzione, nonché i processi di infezione. Lo scambio di DNA tra batteri o tra un batterio e una cellula può essere ottenuto attraverso la trasformazione, coniugazione o trasduzione vettoriale. 1,2 coniugazione è unico rispetto alla trasformazione e trasduzione dal fatto che durante la coniugazione tra batteri gram-negativi come Escherichia coli, il trasferimento del DNA avviene in modo donatore controllato quale un sistema macromolecolare complesso collega cellule donatrici e riceventi. Coniugazione è anche il modo più diretto in cui le cellule batteriche interagiscono con le cellule ospiti per iniettare i geni, proteine ​​o sostanze chimiche a sistemi host. 3 Molto spesso, il trasferimento di tali agenti ha effetti notevoli sulla serie, che vanno dalla patogenesi e carcinogenesi ad ospitare evoluzione e adattamento. E 'stato dimostrato che recombinatio conjugativen aumenta il tasso di adattamento 3 volte nei batteri con alti tassi di mutazione in condizioni di stress ambientale. 4 Inoltre, la coniugazione è di gran lunga la via più comune attraverso il quale si diffondono i geni di resistenza agli antibiotici in ceppi batterici. 5,6

I microrganismi sono evoluti sistemi di secrezione specializzati per supportare il trasferimento di macromolecole attraverso le membrane cellulari; attualmente ci sono 9 tipi di sistemi di secrezione (Tsss) in batteri gram negativi che sono stati descritti: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, così come la Sec (secrezione) e Tat (due-arginina traslocazione) percorsi. 7,8 Ogni tipo di sistema di secrezione è ulteriormente suddiviso in diversi sottotipi, una necessità a causa della diversità delle proteine e la peculiarità di meccanismi coinvolti, in differenti ceppi batterici. Ad esempio, nel sistema di secrezione di tipo IV (T4SS), i sistemi di Ti e Cag facilitano il trasporto effettore che l'F-plasmide, R27 unND pKM101 T4SSs facilitare il trasferimento di un plasmide coniugativo. 7,9,10 Una comprensione dettagliata dei meccanismi attraverso i quali gli organismi assemblano i loro rispettivi sistemi di secrezione dalle loro proteine componenti e condividono contenuti cellulari con un destinatario o il loro ambiente circostante è un fattore importante per lo sviluppo di strategie mirate per combattere i microrganismi e processi di patogeni infezione cellulare.

Dopo l'identificazione coniugazione batterica iniziale in E. coli da Lederberg e Tatum, 11 sono state identificate e caratterizzate numerose plasmidi mobili e coniugazione. 12 Tali plasmidi mobili mostrano notevole gamma è formato (da 1 a oltre 200 kilobasi (kb)), tuttavia tutti i plasmidi mobili contengono una relaxase, che riconosce l'origine di trasferimento (orit) consentendo così la trasmissione del plasmide. plasmidi coniugativi ulteriori geni codificano per il montaggio di un T4SS funzionale così come un tipoIV proteine ​​accoppiamento. 12 Ad esempio 100 kb F plasmide di E. coli codifica tutti i geni coniugazione di una regione (tra) 33,3 trasferimento kB. 13 I geni della regione Tra del plasmide codifica F tutte le proteine che facilitano la formazione di pilus, accoppiamento formazione coppia (MPF), il trasferimento del DNA e le funzioni di esclusione durante il trasferimento plasmide conjugative. 10,14,15 un corpus significativo di conoscenze è disponibile per conjugative T4SSs, per quanto dettagliati studi strutturali delle proteine e dei complessi di coniugazione sono solo più di recente diventando disponibili. 16 – 28

Per assemblare una visione complessiva del processo conjugative, è necessario un accoppiamento di studi strutturali dettagliate per mutazionale analisi delle proteine ​​di trasferimento coniugazione. Ciò può essere ottenuto mediante saggi accoppiamento coniugazione. Per il plasmide F, ciascuna proteina codificata all'interno della regione di tra gioca un ruolo nella co F-mediatanjugation; Pertanto, il knockout / delezione di un gene transfer abolisce la capacità conjugative della cella (Figura 1). Mentre più piccoli plasmidi mobili sono più favorevoli per le procedure di cancellazione standard per i plasmidi coniugazione più grandi come F, knockout genici si ottengono più facilmente tramite ricombinazione omologa in cui il gene bersaglio viene sostituito con uno trasmettere un distinto gene di resistenza agli antibiotici. Nel protocollo corrente, ci avvaliamo di ricombinazione omologa per sostituire un gene trasferimento di interesse con cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) nella 55 kb F plasmide derivato pOX38-Tc; 29,30 plasmide knockout risultante, pOX38-Tc Δgene :: Cm, facilita resistenza alla presenza di cloramfenicolo (Cm) in terreni di crescita. Cellule del donatore ospitano pOX38-Tc Δgene :: Cm potuto influenzare conjugative trasferimento di DNA / accoppiamento come osservata attraverso l'uso di un saggio di accoppiamento; l'efficienza di accoppiamento di una cellula donatrice pOX38-Tc Δgene :: cm e una recip normaleiente diminuirà o, più spesso, essere abolito. trasferimento conjugative del plasmide pOX38-Tc Δgene :: Cm può essere ripristinato tramite un piccolo plasmide recupero ospitare il gene trasferimento mirato. Questo plasmide recupero può essere uno che fornisce l'espressione costitutiva, come plasmide pK184 (pK184-gene), 31 o uno che fornisce l'espressione inducibile finché tale plasmide obiettivi correttamente il gene nella posizione corretta all'interno della cellula (citoplasma o periplasma). Di conseguenza, in saggi di accoppiamento tra questo nuovo donatore (ospitare pOX38-Tc Δgene plasmidi :: Cm + pK184-gene) ed una cellula ricevente, l'efficienza di accoppiamento è previsto per ripristinare quasi quella di un normale dosaggio accoppiamento donatore-ricevente. Questo sistema permette di sondare la funzione del gene eliminato attraverso la generazione di una serie di costrutti pK184 gene (delezioni o mutazioni puntiformi) e testare la capacità di ogni costrutto di ripristinare la capacità di accoppiamento del harbouring pOX38-Tc Δgene :: Cm cellula donatriceS.

Protocol

1. Generazione di costrutti di DNA Progettare oligomeri per ricombinazione omologa del gene bersaglio Progettare un singolo 55-72 bp oligomero avanti come segue: (a) scegliere un 19-32 bp lunga sequenza nucleotidica che è omologa ad una sequenza di DNA della regione 10-100 bp a monte del sito di inizio della 5 'del gene acetiltransferasi cloramfenicolo nel plasmide pBAD33 commerciale, 32 e (b) selezionare un 36-54 bp lunga sequenza nucleotidica omologa ad una regione …

Representative Results

Il processo di F coniugazione batterica plasmide-driven è un processo coordinato che coinvolge le proteine di trasferimento all'interno della regione Tra della F-plasmide che assembla un T4SS per facilitare la sintesi pilus e il trasferimento di DNA coniugativo. La proteina traffico (GenBank adesione # BAA97961; UniProt ID P14497) è necessario per conjugative formazione F-pilus. 10,14,35 – 37 La proteina contiene un dominio tioredossina com…

Discussion

processo Coniugazione batterica fornisce un mezzo attraverso il quale i batteri possono diffondersi geni mediante un vantaggio evolutivo di crescita in ambienti difficili, come la diffusione di marcatori di resistenza agli antibiotici. Poiché molti dei plasmidi coniugativi sono così grandi, 12 studi funzionali sulle proteine coinvolte nel montaggio del dispositivo di trasferimento attraverso la mutazione di geni bersaglio sul plasmide coniugativo si sono ingombranti. I protocolli descritti qui forniscono un…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del Discovery Sciences & Engineering Consiglio Naturale del Canada (NSERC).

Materials

GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit Fisher Scientific K0503
GeneJet Gel Extraction Kit Fisher Scientific K0692
GeneJet PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S
Broad Range DNA Ladder New England Biolabs N0303A
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713
Electroporator Eppendorf 4309000027
Electroporation cuvettes Fisher Scientific FB101 Cuvettes have a 1 mm gap.
Enzymes
AvaI New England Biolabs R0152S
EcoRI New England Biolabs R0101S
HindIII New England Biolabs R0104L
NdeI New England Biolabs R0111S
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
DpnI New England Biolabs R0176S
Antibiotics Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100 20 µg/mL
Kanamycin (Km) BioBasic Inc. DB0286 50 µg/mL
Nalidixic acid (Nal) Sigma-Aldrich N8878-25G 10 µg/mL
Rifampicin (Rif) Calbiochem 557303 20 µg/mL
Tetracycline (Tc) Fisher Scientific BP912-100 10 µg/mL
Streptomycin (Sm) Fisher Scientific BP910-50 50 µg/mL
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Riferimenti

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Erdogan, F., Lento, C., Yaseen, A., Nowroozi-Dayeni, R., Kheyson, S., Audette, G. F. Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (119), e54854, doi:10.3791/54854 (2017).
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