Konjugerbare Mating Analyser for sekvens-spesifikk analyse av Transfer proteiner involvert i Konjugasjon
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
Overføring av gener og proteiner i mikroorganismenivå spiller en sentral rolle i bakteriell overlevelse og utvikling, samt infeksjon prosesser. Utvekslingen av DNA mellom bakterier eller mellom en bakterie og en celle kan oppnås ved transformasjon, konjugasjon eller en vektor transduksjon. 1,2 Bøyning er unik i forhold til transformasjon og transduksjon ved at under konjugeringen mellom gram-negative bakterier som Escherichia coli, overføring av DNA finner sted i et donor-kontrollert måte hvorved et komplekst system makromolekylært forbinder giver- og mottakercellene. Bøyning er også den mest direkte måten bakterieceller kommuniserer med vertsceller for å injisere gener, proteiner eller kjemikalier på vertssystemer. 3 Ganske ofte, overføring av slike midler har bemerkelsesverdig effekt på verten, alt fra patogenesen og kreft å være vert for utvikling og tilpasning. Det har vist seg at konjugerbare recombination øker frekvensen av tilpasning tre ganger i bakterier med høye mutasjon priser under forhold med miljøstress. 4 Videre er konjugasjon langt den vanligste rute der antibiotikaresistensgener i bakteriestammer er spredt. 5,6
Mikroorganismer har utviklet spesialiserte sekresjon systemer for å støtte overføring av makromolekyler over mobilnettet membraner; Det er for tiden 9 typer sekresjon systemer (TSSs) i gramnegative bakterier som har blitt beskrevet: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, samt Sec (sekresjon) og Tat (to-arginin trans) trasé. 7,8 Hver type sekresjon system er videre delt inn i forskjellige undergrupper, en nødvendighet på grunn av mangfoldet av proteiner og særpreg veier som er involvert, i forskjellige bakteriestammer. For eksempel, i den type IV sekresjon system (T4SS), Ti og CAG systemer er det lettere effektor transport, mens F-plasmid, en R27nd pKM101 T4SSs lette overføring av en konjugativt plasmid. 7,9,10 En detaljert forståelse av de mekanismer som organismer montere sine respektive sekresjon systemer fra sine komponent proteiner og dele cellulære innholdet med en mottaker eller deres omgivelsene er en viktig faktor i utviklingen av målrettede strategier for å bekjempe sykdomsfremkallende mikroorganismer og prosesser cellular infeksjon.
Etter den første identifikasjon Konjugasjon i E. coli ved Lederberg og Tatum, 11 et stort antall mobile og konjugativt plasmider er blitt identifisert og karakterisert. 12 Slike flyttbare plasmider viser betydelig område er størrelse (fra en til over 200 kilobaser (kb)), men alle mobil plasmider inneholder en relaxase, som gjenkjenner opprinnelsen til overførings (Orit) for derved å muliggjøre overføring av plasmidet. Konjugativt plasmider som koder for ytterligere gener for montering av en funksjonell T4SS, så vel som en typeIV kobling protein. 12 For eksempel 100 kb F plasmid av E. coli koder alle konjugerbare genene innen en 33,3 kB transfer (ekstra) region. 13 Genene i tra regionen i F-plasmidet kode alle proteiner som letter pilus dannelse, parring par dannelse (MPF), DNA overføring og eksklusjons funksjoner under konjugativt plasmid overføring. 10,14,15 En betydelig mengde kunnskap er tilgjengelig for konjugerbare T4SSs, men detaljerte strukturstudier av konjugerbare proteiner og komplekser er bare mer nylig blitt tilgjengelig. 16-28
For å sette sammen et helhetlig syn på konjugerbare prosessen, er en kobling av detaljerte strukturstudier til mutasjonsanalyser konjugerbare overførings proteiner nødvendig. Dette kan oppnås gjennom konjugativt passende analyser. For F-plasmidet, hvert protein kodet innenfor den tra regionen spiller en rolle i den F-mediert conjugation; derfor vil den knockout / sletting av en overføring gen avskaffe konjugativt kapasitet av cellen (figur 1). Mens mindre mobile plasmider i større grad bidrar til standard sletting prosedyrer, for større konjugativt plasmider slik som F, blir genet knockouts lettere oppnås via homolog rekombinasjon, hvor målgenet er erstattet med en transport en tydelig antibiotisk resistensgen. I dagens protokoll, ansetter vi homolog rekombinasjon å erstatte en overføring gen av interesse med kloramfenikol acetyltransferase (CAT) i 55 kb F plasmid derivat pOX38-Tc; 29,30 knockout det resulterende plasmid, pOX38-Tc Δgene :: Cm, letter motstand av tilstedeværelsen av kloramfenikol (Cm) i vekstmediet. Donor celler som pOX38-Tc Δgene :: Cm er ute av stand til å påvirke konjugativt DNA-overføring / paring som observeres ved bruk av en parring assay; parring effektiviteten av en pOX38-Tc Δgene :: Cm donorcelle og en normal Recipient vil redusere eller, oftere, bli avskaffet. Konjugerbare overføring av pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmid kan gjenopprettes via en liten bedring plasmid målrettet overføring genet. Denne gjenopprettings plasmid kan være en som gir konstituerende uttrykk, slik som plasmid pK184 (pK184-genet), 31 eller en som gir induserbar uttrykk så lenge at plasmid ordentlig rettet genet til riktig sted inne i cellen (cytoplasma eller periplasmaet). Følgelig, i parrings analyser mellom denne nye donor (husing pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-genet plasmider) og en mottagercelle, er paring effektivitet forventes å gjenopprette til nesten den for en normal donor-mottaker parring analysen. Dette systemet gjør det mulig å undersøke funksjonen av det slått ut-genet ved generering av en serie av pK184-genkonstruksjoner (delesjoner eller punktmutasjoner) og testing av hver enkelt konstruksjon evne til å gjenopprette parring kapasiteten til pOX38-Tc Δgene :: Cm husing donor celles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konjugasjon fremgangsmåte tilveiebringer et middel som bakterier kan spres gener som gir en evolusjonær fordel for vekst i krevende miljøer, slik som spredning av antibiotika resistensmarkører. Fordi mange av konjugativt plasmider er så store, 12 funksjonelle studier på de som er involvert i sammenstillingen av overføringsapparatet gjennom mutasjon av målgener på konjugativt plasmid selv proteiner er uhåndterlig. Protokollene beskrevet heri tilveiebringe en anordning ved hvilken man kan lettere vurd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av en Discovery Grant fra Natural Sciences & Engineering Council of Canada (NSERC).
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
References
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
- Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
- Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
- Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).
