Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

Summary

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Abstract

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Introduction

Перенос генов и белков на микро-организменном уровне играет центральную роль в выживаемости бактерий и эволюции, а также инфекционных процессов. Обмен ДНК между бактериями или между бактерией и клеткой может быть достигнуто с помощью трансформации, конъюгации или вектором трансдукции. ^1,2 Сопряжение уникальна по сравнению с трансформацией и трансдукции в том , что при конъюгации между грамотрицательных бактерий , таких как кишечная палочка, перенос ДНК происходит в донорной-контролируемым способом , посредством которого комплекс макромолекулярная система соединяет донора и реципиента клетки. Сопряжение также самый прямой путь, в котором бактериальные клетки взаимодействуют с клетками-хозяевами, чтобы ввести гены, белки или химические вещества, чтобы хост-системах. ³ Довольно часто, передача таких агентов имеет замечательные эффекты на хозяина, начиная от патогенеза и канцерогенеза провести эволюцию и адаптацию. Было показано, что конъюгативная recombinatioп увеличивает скорость адаптации в 3 раза у бактерий с высоким уровнем мутаций в условиях экологического стресса. ⁴ Кроме того, конъюгация на сегодняшний день является наиболее распространенным путем , через который гены устойчивости к антибиотикам в бактериальных штаммов рассредоточены. ^5,6

Микроорганизмы развивались специализированные системы секреции для поддержки передачи макромолекул через клеточные мембраны; Есть в настоящее время 9 типов систем секреции (ЦСС) в грамотрицательных бактерий, которые были описаны: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, а также Sec (секреции) и Tat (два-Аргинин транслокации) пути. ^7,8 Каждый тип системы секреции дополнительно делится на различные подтипы, необходимость из – за разнообразия белков и своеобразия путей , участвующих в различных бактериальных штаммов. Например, в системе секреции IV типа (T4SS), системы Ti и CAG облегчают эффекторной транспорт в то время как F-плазмиды, Р27й pKM101 T4SSs облегчают передачу конъюгативной плазмиды. ^7,9,10 Детальное понимание механизмов , с помощью которых организмы собирают свои системы секреции из их составных белков и разделяют клеточное содержимое с получателем или их окружающей среды является важным фактором в развитии целевых стратегий борьбы с патогенными микроорганизмами и процессы клеточная инфекция.

После первоначальной идентификации конъюгации бактерий в E.coli путем Ледербергом & Tatum, ¹¹ большое количество мобильных и конъюгативных плазмид были идентифицированы и охарактеризованы. ¹² Такие мобильные плазмид показывают значительный диапазон размеров (от 1 до более чем 200 т.п.н. (КБ)), однако все мобильные плазмиды содержат relaxase, признающей происхождение передачи (ОРИТ) , тем самым позволяя передачу плазмиды. Конъюгативных плазмид дополнительные гены кодируют для сборки функционального T4SS, а также типIV соединительный белок. ¹² Например, 100 кб F плазмиды E.coli , кодирует все конъюгативных гены в пределах 33,3 кБ передачи (TRA) области. ¹³ Гены ТНС области плазмиды закодировать F все белки , которые способствуют образованию фимбриевый, присоединительными образования пар (MPF), перенос ДНК и функции исключения во время конъюгативного переноса плазмиды. ^10,14,15 Значительный объем знаний доступен для конъюгативной T4SSs, однако подробно Структурные исследования конъюгативных белков и комплексов только в последнее время становятся доступными. ^{16 – 28}

Для того, чтобы собрать полное представление о конъюгативной процесса, соединительное детальных структурных исследований для мутационный анализ конъюгативных белков переноса требуется. Это может быть достигнуто с помощью конъюгативных сопрягаемых анализов. Для получения плазмиды F, каждый белок , кодируемый в пределах области тра играет определенную роль в F-опосредованного соnjugation; поэтому, нокаута / удаление гена переноса отменит конъюгативных способность клетки (рисунок 1). В то время как более мелкие мобильные Плазмиды являются более благоприятными для стандартных процедур, удаление, для больших конъюгативных плазмид, таких как F, нокаут гена более легко достигается с помощью гомологичной рекомбинации, где ген-мишень заменен одним передать отчетливое ген устойчивости к антибиотику. В текущем протоколе, мы используем гомологичной рекомбинации, чтобы заменить ген переноса интереса с хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в 55 кб F плазмиды производное pOX38-Tc; ^29,30 результирующая Нокаут плазмиду pOX38-Tc Δgene :: Cm, способствует устойчивости к наличию хлорамфеникола (Cm) в ростовой среде. Донорские клетки, несущие pOX38-Tc Δgene :: Cm не могут влиять на конъюгативного переноса ДНК / спаривание, как наблюдаемое за счет использования пробирного сопрягаемой; эффективность спаривание донора клетки pOX38-Tc Δgene :: Cm и нормальный Recipнике, будет уменьшаться или, чаще, быть отменена. Конъюгативных перенос плазмиды pOX38-Tc Δgene :: Cm может быть восстановлен с помощью небольшой плазмиды восстановления укрывает целевого гена переноса. Это восстановление плазмида может быть тот , который обеспечивает конститутивную экспрессию, такой как плазмида pK184 (pK184-гена), ³¹ или тот , который обеспечивает индуцируемой экспрессии до тех пор , как плазмида правильно ориентирована ген на правильное расположение внутри клетки (цитоплазме или периплазмы). Следовательно, в брачных анализах между этим новым донором (укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-гена плазмид) и клетку-реципиент, эффективность спаривание, как ожидается, восстановление до почти у нормального донора и реципиента сопрягаемой анализа. Эта система дает возможность исследовать функцию выбиты гена через поколение серии pK184-генных конструкций (делеции или точечные мутации) и тестирование способности каждой конструкции, чтобы восстановить брачный потенциал укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm донор клетокs.

Protocol

1. Получение ДНК-конструктов Проектирование олигомеров для гомологичной рекомбинации гена – мишени Конструкция одного 55-72 п.н. вперед олигомера следующим образом: (а) получить длинную последовательность нуклеотидов 19-32 п.н., которая является гомологичной по…

Representative Results

Процесс F плазмиды управляемой бактериальной конъюгации представляет собой скоординированный процесс , который включает в себя белки переноса в тра области F-плазмиды , которая собирает T4SS для облегчения синтеза фимбриевый и конъюгативных перенос ДНК. Белок TRAF (G…

Discussion

Бактериальный процесс конъюгации обеспечивает средства, с помощью которых бактерии могут распространяться гены обеспечивая эволюционное преимущество для роста в сложных условиях, таких как распространение маркеров устойчивости к антибиотикам. Поскольку многие из конъюгативных пл?…

Materials

GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit	Fisher Scientific	K0503
GeneJet Gel Extraction Kit	Fisher Scientific	K0692
GeneJet PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit	New England Biolabs	E0554S
Broad Range DNA Ladder	New England Biolabs	N0303A
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713
Electroporator	Eppendorf	4309000027
Electroporation cuvettes	Fisher Scientific	FB101	Cuvettes have a 1 mm gap.
Enzymes
AvaI	New England Biolabs	R0152S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
HindIII	New England Biolabs	R0104L
NdeI	New England Biolabs	R0111S
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
DpnI	New England Biolabs	R0176S
Antibiotics			Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm)	Fisher Scientific	BP904-100	20 µg/mL
Kanamycin (Km)	BioBasic Inc.	DB0286	50 µg/mL
Nalidixic acid (Nal)	Sigma-Aldrich	N8878-25G	10 µg/mL
Rifampicin (Rif)	Calbiochem	557303	20 µg/mL
Tetracycline (Tc)	Fisher Scientific	BP912-100	10 µg/mL
Streptomycin (Sm)	Fisher Scientific	BP910-50	50 µg/mL