JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

Published: January 04, 2017
doi:
10.3791/54854
, , , , ,
1Department of Chemistry,York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions,York University

Summary

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Abstract

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Introduction

Mikro-organizma düzeyinde genler ve proteinlerin transferi bakteriyel hayatta kalma ve evrim yanı sıra enfeksiyon süreçlerinde önemli bir rol oynar. bakteriler arasında ya da bir bakteri, bir hücre arasındaki DNA değişimi dönüşümü, konjugasyon veya vektör iletimi yoluyla elde edilebilir. 1,2 Konjugasyon Escherichia coli gibi gram negatif bakteriler arasında konjugasyon sırasında dönüşüm ve transdüksiyon kıyasla benzersizdir, DNA transferi kompleks makromoleküler sistemi, verici ve alıcı hücrelerin birbirine bağlayan ve böylece bir verici-kontrollü bir şekilde meydana gelir. Konjugasyon ayrıca bakteri hücrelerinin ana bilgisayar sistemleri için genler, proteinler veya kimyasal enjekte konak hücreleri ile etkileşim içinde en doğrudan yoludur. 3 Oldukça sık, bu tür maddelerin transferi evrimini ve adaptasyon barındırmak için patogenez ve karsinogenez arasında değişen ana bilgisayarda olağanüstü etkileri vardır. O konjugatif recombinatio gösterilmiştirn çevresel stres koşullarında yüksek mutasyon oranları ile bakterilerde adaptasyon 3 kat oranını artırır. 4 Dahası, konjugasyon bakteri türleri antibiyotik direnç genleri yayılır, üzerinden kadar en yaygın yol kullanılarak verilir. 5,6

Mikroorganizmalar hücre zarları arasında makromoleküllerin transferini desteklemek için özel salgı sistemlerinin geliştiğini; tarif edilmiştir de gram negatif bakterilere salgılama sistemleri (TSSler) 9 tip şu anda: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, hem de SEC (sekresyon) ve Tat (iki arginin translokasyon) yollar. Salgı sistemi 7,8 Her tür daha farklı bakteri suşları nedeniyle protein çeşitliliği ve ilgili yolların ayırt edicilik için, farklı alt tipe bir zorunluluk ayrılmıştır. Örneğin, tip IV sekresyon sistemi (T4SS) 'de, Ti ve Çağ sistemleri F-plazmid ise efektör taşımacılığının kolaylaştırılması, R27 and pKM101 T4SSs bir konjugatif plazmid transferini kolaylaştırmak. Organizmaların bir alıcı ya da çevresindeki çevre ile hücresel içeriği kendi bileşen proteinlerden kendi salgı sistemlerini monte ve paylaşmak hangi mekanizmaların 7,9,10 ayrıntılı bir anlayış patojen mikroorganizmaları ve süreçlerini mücadele etmek için hedeflenen stratejilerin geliştirilmesinde önemli bir faktördür hücresel enfeksiyon.

Lederberg ve Tatum, 11 E. coli içinde, ilk kimlik bakteriyel konjugasyon aşağıdaki mobil ve birleştirici plazmit, çok sayıda belirlenmiş ve karakterize edilmiştir. 12 Bu tür mobil plazmidler ancak tüm mobil plazmidler transferi (oriT) böylece plazmid aktarımını sağlayan kökenini tanıyan bir relaxase içeren, kayda değer aralığı (1 200'den fazla kilobaz (kb) için) boyutu olduğunu gösteriyor. Konjügatif fonksiyonel T4SS montajı için plazmidler daha kodlayan genler aynı zamanda bir türIV birleştirme proteini. 12 Örneğin, E. coli 100 kb F plazmid bir 33.3 kB transferi (tra) bölgedeki tüm konjugatif genleri kodlar. 13 çifti oluşumu (Mpf), DNA transferi ve dışlama fonksiyonlarını çiftleşme pilus oluşumunu kolaylaştırmak tüm proteinler, konjugatif plazmid transferi sırasında F plazmid kodlamak tra bölgesinde genler. 10,14,15 bilginin önemli bir vücut konjugatif T4SSs için kullanılabilir, ancak sadece son zamanlarda kullanılabilir hale gelmektedir konjugatif protein ve komplekslerinin yapısal çalışmalar detaylı. 16-28

konjugatif işlem kapsamlı bir görünümünü monte etmek için, eş transfer proteinlerinin analiz mutasyon için, ayrıntılı yapısal çalışmaların bir bağlantı gereklidir. Bu konjugatif çiftleşme deneyleri ile elde edilebilir. F plazmid için tra bölge içinde kodlanan her protein F aracılı co bir rol oynarnjugation; Bu nedenle, bir transfer geninin nakavt / silme hücre (Şekil 1) konjugatif kapasitesini ortadan kaldıracaktır. küçük mobil plazmidler, F gibi daha büyük konjugatif plasmidler için, standart silme işlemleri için elverişli iken hedef gen, bir farklı antibiyotik dirençli bir gen taşıyıcı ile değiştirilmiş olduğu, bir gen nakavt daha kolay homolog rekombinasyon yoluyla elde edilir. Geçerli protokol, 55 kb F plazmid türevi pOX38-Tc kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) ile ilgi bir transfer geni yerine homolog rekombinasyon istihdam; 29,30 Elde edilen nakavt plasmid pOX38-Tc Δgene :: Cm büyüme ortamında kloramfenikol varlığında (cm) karşı direnç kolaylaştırır. pOX38-Tc Δgene :: Cm barındıran donör hücreleri bir çiftleşme testinin kullanımı yoluyla gözlemlenen konjugatif DNA transferi / çiftleşme etkileyecek edemiyoruz; Bir pOX38-Tc Δgene :: Cm donör hücre çiftleşme verimliliği ve normal bir tilki kuyruğusağ- lasa daha sık, kaldırılmasını, azaltmak veya edecektir. pOX38-Tc Δgene :: Cm plazmid konjugatif transferi hedeflenen transferi genini barındıran küçük bir iyileşme plazmid aracılığıyla restore edilebilir. Bu kurtarma plazmid gibi plazmid pK184 (pK184-gen), 31 ya da çok uzun plazmid düzgün hücre (sitoplazma veya periplasmasında) içinde doğru konuma geni hedef olarak uyarılabilir ifade sağlayan biri olarak, kurucu ifade sağlar biri olabilir. Sonuç olarak, bu yeni verici arasındaki birleşme deneylerinde (pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-geni plazmidler) ve bir alıcı hücre, çiftleşme verimi neredeyse o normal bir alıcı ve verici arasındaki çiftleşme testinin geri yüklemek için bekleniyor. Bu sistem, pK184-gen yapılarına (silme ya da nokta mutasyon) bir dizi nesil boyunca elendikçe genin işlevini prob ve pOX38-Tc Δgene :: Cm barındıran birleşme kapasitesini yeniden kazandırmak için, her yapı yeteneğini test edilmesine imkan verici hücres.

Protocol

DNA yapılan, 1. Üretim Hedef genin homolog rekombinasyon için oligomerler Tasarımı Aşağıda, tek 55-72 bp ileri oligomer Tasarım: (a), kloramfenikol asetiltransferaz geni 5 'başlangıç ​​sitesinin yukarı bölgesi 10-100 bp bir DNA dizisine homolog olan bir 19-32 bp uzunlukta nükleotit sekansını çekme ticari pBAD33 plazmid olarak, 32 ve (b) bir bölge hedef genin 5 'başlangıç sitesinin alt 10-150 bp'lik bir 36-54 bp uzunlukta nükleotit sek…

Representative Results

F plazmid odaklı bakteriyel konjugasyon bir işlem pilus sentezi ve karşılıklı DNA transferi kolaylaştırmak için bir T4SS araya F-plazmidinin tra bölgesi içinde transfer proteinleri içeren koordineli bir süreçtir. Protein TRAF (GenBank erişim # BAA97961, UniProt İD P14497) konjugatif F pilus oluşumu için gereklidir. 10,14,35 – katalitik CXXC motifi olmayan da 37 proteini, bir C-terminali tioredoksin-benzeri domain içerir. Bu N-t…

Discussion

Bakteriyel konjugasyon işlemi bakterileri gibi antibiyotik direnç belirteçlerin yayılması gibi zorlu ortamlarda büyümesi için evrimsel bir avantaj sağlayan genleri yayılabilir hangi bir araç sağlar. Konjugatif plazmid çok çok büyük olduğundan, konjugatif plazmid kendisini hedef genlerin mutasyon yoluyla transferi cihazının montajı katılan proteinler üzerinde 12 fonksiyonel çalışmalar hantal vardır. Bu tarifnamede ayrıntılı protokolleri, bir daha kolaylıkla daha küçük, daha ida…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi Discovery Grant (NSERC) tarafından desteklenmiştir.

Materials

GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit Fisher Scientific K0503
GeneJet Gel Extraction Kit Fisher Scientific K0692
GeneJet PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S
Broad Range DNA Ladder New England Biolabs N0303A
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713
Electroporator Eppendorf 4309000027
Electroporation cuvettes Fisher Scientific FB101 Cuvettes have a 1 mm gap.
Enzymes
AvaI New England Biolabs R0152S
EcoRI New England Biolabs R0101S
HindIII New England Biolabs R0104L
NdeI New England Biolabs R0111S
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
DpnI New England Biolabs R0176S
Antibiotics Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100 20 µg/mL
Kanamycin (Km) BioBasic Inc. DB0286 50 µg/mL
Nalidixic acid (Nal) Sigma-Aldrich N8878-25G 10 µg/mL
Rifampicin (Rif) Calbiochem 557303 20 µg/mL
Tetracycline (Tc) Fisher Scientific BP912-100 10 µg/mL
Streptomycin (Sm) Fisher Scientific BP910-50 50 µg/mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
  2. Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
  3. Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
  4. Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
  5. Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
  6. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  7. Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
  8. Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
  9. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  10. Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
  11. Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
  12. Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  13. Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
  14. Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
  15. Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
  16. Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
  17. Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
  18. Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
  19. Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
  20. Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
  21. Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
  22. Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
  23. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
  24. Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
  25. Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
  26. Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
  27. Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
  28. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
  29. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
  30. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  31. Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
  32. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  33. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
  34. Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
  35. Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
  36. Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
  37. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
  38. Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
  39. Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
  40. Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
  41. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  42. Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
  43. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
  44. Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).

Tags

Conjugative Mating AssaysTransfer ProteinsBacterial ConjugationType Four Secretion ComplexHomologous RecombinationPBAD33 PlasmidCat CassettePCR AmplificationElectrocompetent DY330R CellsPOX38-Tc Plasmid
check_url/54854?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Erdogan, F., Lento, C., Yaseen, A., Nowroozi-Dayeni, R., Kheyson, S., Audette, G. F. Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (119), e54854, doi:10.3791/54854 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image